家蚕Bombyx mori病原微生物种类繁多，可引发多种传染性蚕病，主要包括病毒病、细菌病、真菌病和原生动物病等（图 1）。病毒性蚕病以高发性、强传染性和难防控为特征，其中家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）、家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV）和家蚕浓核病毒（Bombyx mori densovirus, BmDNV）引发的三大病毒病造成的损失占蚕病总损失的80%左右（蒋亮等，2014）。细菌病主要包括芽孢杆菌属Bacillus spp.引发的败血病、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis所致的细菌性中毒病，以及肠球菌属Enterococcus spp.引发的细菌性肠道病（万永继，2023）。真菌病害通过分生孢子侵染机制引发（夏建国，1993），感染体呈现体表显色僵化特征，典型病症包括白僵病Beauveria bassiana、黄僵病Metarhizium flavoviride、绿僵病Nomuraea rileyi等（胡仕叶等，2008）。家蚕原生动物病主要由家蚕微孢子虫Nosema bombycis引起，是蚕业生产中唯一法定检疫对象（沈中元，2003）。此外，非传染性蚕病也同样威胁着家蚕健康，例如中毒症、节肢动物危害、生理性病害，虽无传染性，但需通过桑园生态调控、环境优化及规范管理进行有效防控，是蚕业生产中不可忽视的关键风险环节。

图  1  家蚕病原微生物分类图

Fig.  1  Classification diagram of pathogenic microorganisms in Bombyx mori

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家蚕在高密度饲养过程中容易遭受各类病原生物的侵染，从而导致蚕茧产量与质量下降，造成重大经济损失，而病原检测作为蚕病防治的第一道防线，其准确性和及时性直接决定了防治措施的有效性，只有快速明确致病病原，才能针对不同病原的特性采取精准防控手段，有效遏止病害扩散，最大程度减少损失。因此快速准确诊断家蚕致病病原体意义重大。为此，本文梳理并综述家蚕病原微生物的常用检测方法，以期为家蚕病原微生物的精确诊治、科学防控提供参考。

1.   蚕病检测技术

病原微生物检测技术通过特异性识别与定量分析样品中目标微生物，实现病原体精准筛查与诊断，是家蚕病害防控及蚕业可持续发展的关键支撑。传统检测方法以形态学观察为主，如显微镜技术，依赖病原体形态特征进行初步判断，具有直观性但受限于灵敏度与特异性。随着免疫学技术的革新，基于抗原-抗体反应的酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫荧光技术（Immunofluorescence assay，IFA）技术及免疫层析技术（Immunochromatographic assay，ICA）显著提升了检测效率，兼具快速性与实用性，尤其适用于现场筛查。生物学技术的引入推动检测迈向高灵敏与高精准阶段，多重PCR（Multiple polymerase chain reaction，multiplex PCR）、实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）等技术通过靶向扩增病原核酸实现高特异性检测；而环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification，RAA）等技术无需复杂仪器，为基层应用场景提供低成本解决方案。新兴交叉技术中，电化学生物传感通过信号转换与放大优化检测限；以二代测序（Next-generation sequencing，NGS）为代表的高通量技术，通过宏基因组分析实现了未知病原的全面筛查。此外，CRISPR/Cas系统凭借其精准的基因编辑能力，被创新性应用于病原核酸的快速识别与信号输出，推动了现场即时检测（Point-of-care testing，POCT）的发展（图 2，表 1）。

图  2  家蚕病原微生物检测技术发展图

Fig.  2  Evolution diagram of detection technologies for pathogenic microorganisms in Bombyx mori

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1.1   基于形态学观察的检测技术

1.1.1   显微镜检测技术

19世纪中期，巴斯德发现家蚕微孢子虫给法国的蚕业造成了重大损失，经过大量的探索，创立了母蛾镜检法（王见杨等，2000）。通过显微镜直接观察检测，可有效淘汰病蛾所产卵，显著降低微粒子病传播风险。相较于原始肉眼观察法，传统镜检虽操作简便且有所改进，但仍存在特异性不足、灵敏度受限等问题，因其高度依赖形态学判读。同时，由于人工操作主观性强，误差风险大，在对微孢子虫进行镜检时，特别是对于感染初期的检测，容易出现漏检现象，且长时间镜检易导致视觉疲劳，误判概率增加，局限性显著。为解决这些问题，显微镜技术与染色方法结合：唐顺明等（2002）采用铬变素2R法（Chromotrope 2R）染色，染色后的Nosema bombycis孢子呈粉红色，与其形状相似物未被染成红色，一目了然能有效减少因样本中含有形状类似物而误检或漏检的情况。刘吉平等（2007）采用荧光增白剂M2R（Calcofluor White M2R）荧光染色法，通过荧光染料穿透孢子外壳并与内壁几丁质特异性结合，可产生稳定的荧光信号。真菌孢子因几丁质含量或分布差异，荧光信号较弱，实现精准区分。与此同时，研究者开发了基于快速Otsu自动阈值分割法的图像识别系统，通过图像对比处理与二值化分割实现微粒子与背景杂质的智能分离，并采用分层识别技术对微粒子进行精准检测，替代了传统人工镜检方法（蔡健荣等，1998；张香琴等，2001）。黄宏华、蔡健荣（2003）利用数学形态学的方法根据微粒子图像的形状特征来检测微粒子区域，实现微粒子和背景的分割，结合基于遗传算法的反向传播网络（Back propagation，BP）完成图像分割与分类，进一步提升检测效率与准确性。随着微观表征技术的发展，电子显微镜技术为检测提供了更高分辨率的工具，Moharrami等（2022）将透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）技术联合应用，对家蚕微孢子虫进行高精度检测，借助扫描电镜，能够精准量化家蚕微孢子虫孢子的尺寸，并清晰观察其表面结构特征。同时，通过透射电镜深入解析孢子内部的超微结构，进而明确了不同发育阶段孢子在形态学上的差异。该联合检测方法突破了传统光学显微镜分辨率的局限，实现了纳米级微观形态鉴定。在此基础上，成功建立了基于电子显微镜技术的高特异性诊断新标准，显著降低了人工经验差异导致的误判风险，提升了家蚕微孢子虫检测结果的准确性，为家蚕微孢子虫相关研究及病害防控提供了坚实可靠的技术支撑。为彻底克服人工镜检的主观性并实现精准自动化，Xue等（2024）创新性地提出将单细胞拉曼光谱技术与自注意力机制（Self-attention mechanism，SAM）引导的卷积神经网络（Convolutional neural network，CNN）相结合，开发了新一代智能孢子识别系统。该系统通过激光镊子拉曼光谱技术（Laser tweezers Raman spectroscopy，LTRS）捕获单个孢子的分子指纹信息，经高斯噪声数据增强处理后输入SAM-CNN模型进行特征提取与分类。实验结果表明，对于9种不同家蚕幼虫来源的孢子样本，改进后的模型平均识别准确率从传统CNN的（83.93 ± 4.88）%显著提升至（99.27 ± 0.25）%。这种技术突破不仅克服了传统镜检技术对孢子形态学特征的过度依赖，更通过深度学习算法实现了孢子检测与分类的自动化和智能化，将人工判读导致的主观误差降至极低水平。

1.2   基于免疫学反应的检测技术

1.2.1   酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是基于抗原-抗体特异性结合原理，将抗原或抗体固定于载体表面，通过酶标记物催化底物显色，实现病原微生物定性或定量检测。根据反应模式不同，可分为直接ELISA、间接ELISA及夹心ELISA等类型。万国富等（1994）建立了直接ELISA法，将辣根过氧化物酶（HRP）标记于单克隆抗体用于检测家蚕微孢子虫，试验表明该方法与间接ELISA的灵敏度和特异性无显著差异，但操作流程更简便。与此同时万淼等（2008）则开发了双抗体夹心ELISA法，以纯化的兔抗家蚕微孢子虫多克隆抗体包被作为捕获抗体，结合HRP标记的单克隆抗体作为检测抗体，对纯化孢子和“添毒”蚕卵的最低检测限分别为3.125×10⁵ spores/mL和5×10⁶ spores/mL，尽管该方法已可应用于生产实践，但灵敏度仍需进一步提升。另一方面，陈建国等（1998）基于完整孢子构建了间接ELISA法，通过酶标二抗的信号放大作用，将检测灵敏度提高至700个孢子水平，但存在与柞蚕微孢子虫Nosema pernyi的交叉反应，这一结果提示需优化抗体特异性以减少干扰。此外，李卫党等（2000）建立的Dot-ELISA法则借助硝酸纤维素膜固定抗原，通过酶标二抗与底物的显色反应形成可见斑点，可根据斑点颜色判断结果，该方法最低能检测到10 ng多角体蛋白，且与人血清、兔血清无交叉反应，展现出良好的特异性。

1.2.2   免疫荧光技术（IFA）

近年来，免疫荧光技术（IFA）以操作简便、特异性强、灵敏度高的独特优势，在家蚕微孢子虫检测及相关研究中得到广泛应用。该技术基于抗原-抗体特异性结合机制，通过荧光素标记二抗实现信号可视化，借助荧光显微镜对目标病原体的荧光信号进行判读，从而完成病原的定性与半定量分析。李艳红等（2006）通过KOH处理结合液氮冻融法提取家蚕微孢子虫总蛋白，以此作为免疫原制备多克隆抗体，进而构建间接IFA检测体系。该方法以FITC标记羊抗兔IgG为二抗，在荧光显微镜下可精准识别家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1中不同发育阶段的微孢子虫，不仅能观察到呈黄绿色荧光的卵圆形孢子及其在宿主细胞内的寄生分布，还能捕捉到孢子极丝弹出的动态过程。该检测体系通过优化抗血清稀释度及多轮条件验证，确保了检测的特异性与稳定性。实验结果显示，阴性对照仅出现少量非特异性荧光，而阳性样本中孢子荧光信号显著，与宿主细胞形成清晰对比。IFA技术凭借快速响应、高特异性、操作便捷等多重优势，不仅为家蚕微粒子病的检疫诊断提供了精准工具，也为微孢子虫的形态学研究、蛋白定位分析等问题奠定了技术基础。

1.2.3   免疫层析技术(ICA)

ICA作为基于抗原-抗体反应的快速诊断技术，凭借操作简便、检测耗时短、结果可视化等优势，在食品安全监测、医学临床诊断、环境污染物筛查等领域应用广泛。该技术起源于20世纪80年代初，核心原理是借助毛细管作用，使样品在条状纤维膜上定向泳动，当样品流经膜上预固定配体的检测区域时，待测物与配体发生特异性结合，通过酶促显色反应或直接利用胶体金等着色标记物，可在20 min内呈现肉眼可见的检测结果（王中民和李君文，2001）。西南大学家蚕微孢子虫研究团队基于这一技术原理开展了系统研究：首先针对家蚕微孢子虫不同靶标蛋白制备单克隆抗体，采用胶体金标记单抗G9构建初代检测体系，该体系以兔抗鼠IgG为质控线，检测线分别喷涂兔多抗或单抗F10，可特异性识别微孢子虫发芽液抗原，但对家蚕组织研磨液中病原体灵敏度不足。随后研究团队进行优化后，以高效价多抗为检测线材料，联合胶体金标记的G9，膜制备与组件工艺改进，最终开发出高灵敏检测试纸条，对碱处理微孢子虫的检测限达10⁵个孢子/mL（周泽扬等，2014）作为胶体金技术在该病害诊断中的首次应用，该研究尽管仍需优化抗体效价及简化操作流程，但已为基层现场筛查奠定重要技术基础。未来有望通过抗体工程技术进一步提升其检测灵敏度与特异性，为家蚕病害防控及病原检疫提供更高效的技术支撑。

1.3   基于核酸扩增的分子检测技术

1.3.1   PCR检测技术

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术是能够在体外对特定DNA序列进行快速复制与扩增的分子生物学技术。在对家蚕病原进行检测的应用中，PCR已被证明在多种家蚕疾病的诊断中具有显著效果（鲁兴萌等，2011）。陈秀等（1996）首次建立了针对家蚕微孢子虫的传统PCR检测方法，基于SSU rRNA基因设计的特异性引物Ⅰ可特异性扩增家蚕微孢子虫，与桑尺蠖微孢子虫Phthonosema sp.无交叉反应。广谱引物Ⅱ则靶向微孢子虫属保守序列，实现了种属水平的精准检测。涂纳新等（1994）针对家蚕BmNPV保守基因ie-1启动子设计特异性引物，通过优化退火温度与循环参数，构建了高灵敏度PCR检测体系。该体系可在感染后12 h内检出病毒DNA，较传统病理学诊断提前48 h以上，为BmNPV疫情的早期预警与传播阻断提供了关键技术支撑。

1.3.2   多重PCR

为进一步提升检测效率和通量，科研人员在传统PCR技术的基础上进行创新，发展出了多重PCR技术。Chamberlain等（1988）于1988年提出多重PCR法的概念，随后这项技术被广泛地应用于各种真菌、细菌、病毒及寄生虫等多种病原体的检测（杨国翠等，2002；Kirschberg et al.，2014；Kimata et al.，2015）。作为标准PCR技术的扩展，多重PCR能够在同一反应体系中同时扩增多个基因位点。该技术的核心优势在于更快速、可适配高通量分析，且经济性更高。G.Ravikumar等（2011）构建了一种多重PCR体系，可同时检测微孢子虫、核型多角体病毒及浓核病毒3种病原。通过靶向微孢子虫16S SSU rRNA基因保守区、BmNPV多角体蛋白基因及BmDNV内部序列设计特异性引物，以48℃作为试验的退火温度进行特异性和灵敏性实验。结果表明，该体系实现了在单一反应中对应地扩增出目的基因，而且无交叉扩增，其最低检测限分别达到1 500个孢子/20 mg组织和3 700个NPV多角体/20 mg组织。随后通过序列匹配验证检测结果的真实性，确保该方法能够准确区分目标病原体与其他潜在病原体或共生微生物。尽管多重PCR技术优势明显，但也存在一定局限性。在实际应用中，多重PCR的引物设计难度较大，需要充分考虑引物间的兼容性、特异性等因素；同时，反应体系的优化也较为复杂，对试验人员的技术水平和经验要求较高。

1.3.3   实时荧光定量PCR（qPCR）

随着对核酸定量检测需求的提升，实时荧光定量PCR技术应运而生。作为一种基于荧光信号监测的核酸定量技术，其核心原理是在PCR扩增过程中，通过荧光染料（如SYBR Green）或荧光探针（如TaqMan探针、Molecular beacon探针）实时追踪DNA扩增量。随着PCR循环进行，目标DNA呈指数级增长，荧光信号强度同步增强，进而通过荧光值检测实现病原的定性与定量分析。在荧光标记体系中，不同类型标记物的适用性存在差异，其中SYBR Green作为非特异性荧光染料，可与所有双链DNA结合，虽具备成本低廉、操作简便的优势，但易受非特异性扩增产物干扰，更适用于初步筛查或靶序列单一的检测场景；TaqMan探针属于序列特异性探针，仅与目标DNA互补结合，通过Taq酶的5'-3'外切酶活性水解探针释放荧光信号，具有特异性强、背景信号低的特点，尤其适合多靶标同步检测，但其探针设计对序列特异性要求较高，且检测成本相对昂贵；Molecular beacon探针则通过茎环结构的构象变化实现荧光淬灭与激活的动态切换，无需依赖酶切即可产生荧光信号，其特异性优于SYBR Green且淬灭效率高，但对反应条件更为敏感，稳定性较TaqMan探针存在一定差距。因此，它适用于对背景信号要求高、需要避免非特异性荧光且反应体系可精密控制的单靶标检测场景。

与传统PCR相比，qPCR无需琼脂糖凝胶电泳，直接通过荧光信号输出结果，操作更为简便，已被广泛应用于病原微生物检测领域（Polley et al.，2011；Erler et al.，2012；Chaimanee et al.，2013）。Fu等（2016）建立了基于实时荧光定量PCR的家蚕微孢子虫检测方法，通过靶向家蚕微孢子虫小亚基rRNA基因设计特异性引物与TaqMan探针，其灵敏度可达10² copies/mL，单个样本中最低可检测10个孢子，显著高于显微镜检测；在400粒蚕卵的对比检测中，qPCR检出195个阳性样本，优于显微镜的167个。该方法不仅能实现病原体检测，还可通过核酸扩增过程中实时采集的荧光信号强度，基于循环阈值（Cycle threshold，Ct）与初始模板浓度的对数线性关系实现病原体核酸的绝对定量，为感染程度评估与防控效果监测提供了重要量化依据。不过，qPCR技术对仪器设备要求较高，检测成本相对昂贵，在基层大规模应用中仍存在限制。因此，实际应用中需结合检测特异性要求、成本预算及操作复杂度综合选择探针类型，以实现检测效能的最优化。

1.3.4   环介导等温扩增（LAMP）

为克服传统PCR技术对复杂热循环设备的依赖，Notomi等（2000）于2000年开发了LAMP技术。这是一种基于多对特异性引物和DNA聚合酶作用的恒温核酸扩增方法，可使目标DNA在短时间内大量扩增，并通过颜色变化或荧光信号实现结果判读。与传统PCR和qPCR相比，LAMP技术省去了高温变性过程，无需复杂热循环设备，不仅显著提升了检测速度和灵敏度，且简化了分子诊断操作，尤其适合现场检测场景。Liu等（2015）基于家蚕微孢子虫特有的、与孢子繁殖复制相关的EB1基因建立了用于检测蚕卵中感染家蚕微孢子虫的LAMP方法。该方法对家蚕微孢子虫的孢子DNA的检测灵敏度为5.0×10^-3 ng/μL，对质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10² copies/μL，在63℃恒温下仅需1.5 h就可以完成检测反应，比常规PCR法节省近1 h以上，该类方法为蚕种质量检验及成品卵微粒子病现场检疫提供了新技术。此外，Zhou等（2015）基于LAMP法研究开发了一种联合侧流试纸（Lateral flow dipstick，LFD）的新型检测技术，用于快速、灵敏地诊断BmNPV。研究针对BmNPV的gp41基因设计4条引物和1条标记探针，在61℃恒温条件下45 min完成DNA扩增，结合LFD试纸5 min内实现可视化检测。其最低检测限低至0.2 pg病毒DNA，灵敏度较传统PCR高100倍，并且与家蚕其他病原体无交叉反应，展现出优异的检测性能。

1.3.5   重组酶介导等温核酸扩增技术（RAA）

作为新型核酸扩增技术，RAA利用来自大肠杆菌Escherichia coli的重组酶RecA促进引物与目标DNA模板之间的同源链配对，协同单链结合蛋白（Single-stranded binding protein，SSB）与链置换DNA聚合酶形成复合体，在恒温条件下进行核酸扩增（毛迎雪等，2024）。以往核酸扩增技术如传统PCR需要变温循环，而RAA技术因其无需加热和降温循环过程，具有操作简单，设备要求低的显著优势，有效弥补了传统技术的局限性。Wang等（2024）开发了一种RAA技术与测流试纸条（LFD）联用的BmNPV快速检测方法。能够在30 min内检测低至6 copies/μL的重组质粒，且在家蚕感染后12 h即可检出BmNPV感染，该方法对BmNPV具有高度特异性，与其他家蚕病原菌无交叉反应。与传统的PCR相比，RAA-LFD检测不仅灵敏度更高，还具备成本优势，可用于家蚕微孢子虫的即时检测。不过，RAA技术目前在引物设计和反应体系稳定性方面仍有待进一步优化。

1.4   电化学生物传感技术

随着检测技术的发展，创新方法不断涌现，电化学与生物学联合检测方法通过整合生物分子特异性识别与电化学信号转导机制，构建了高效灵敏的检测体系。研究人员开发一种基于杂化自组装单分子膜的电化学免疫传感器，实现BmNPV的快速、灵敏、低成本检测。电化学免疫传感器是一种结合免疫学反应与电化学检测技术的生物传感器，将特定物理、化学或生物信号转化为电化学信号，可定量、定性分析待测物质（Wu et al.，2023）。研究人员利用巯基十一酸/巯基乙醇（Mercaptoundecanoic acid/Mercaptoethanol，MUA/ME）混合自组装膜修饰金电极，共价固定BmNPV抗原。当抗原和抗体特异性结合时，引发电极表面绝缘层增厚，阻碍电子传递，导致电化学阻抗显著升高，通过电化学阻抗谱实时监测产生的电化学信号（Sun et al.，2024）。该便携式免疫传感器为户外临床诊断提供了一种新的思路和方法。此外，还有研究人员将电化学与LAMP相结合用于家蚕微孢子虫的检测，核酸聚合反应产生的焦磷酸（Pyrophosphate）通过无机焦磷酸酶水解为无机磷酸（Inorganic phosphate），无机磷酸与酸性钼酸盐反应之后在电极表面形成钼磷酸沉淀，从而产生可测量的电化学信号，结果表明其检测家蚕微孢子虫DNA限度为17 fg/μL（Xie et al.，2015），这进一步拓展了电化学技术在病原检测中的应用场景。

1.5   二代测序技术（NGS）

随着二代测序技术的兴起，标志着基因组学研究迈入高通量时代。2005年，以Roche 454焦磷酸测序、Illumina Solexa、ABI SOLiD及Helicos单分子测序为代表的第二代测序技术平台相继问世，彻底革新了核酸测序的规模与效率（陈伟玲，2023）。作为高通量核酸分析的核心工具，NGS凭借其大规模并行测序能力，可广泛应用于病毒、细菌、真菌及寄生虫等病原体的多个DNA片段进行同步测序，在显著提升检测通量的同时大幅降低成本（Gwinn et al.，2019）宏基因组测序等二代测序技术已逐渐应用于家蚕病原微生物的检测。与传统培养法相比，Illumina MiSeq测序技术不仅避免了培养过程的误差，缩短了检测时间，更能够在门属水平解析肠道菌群结构，精准识别传统培养条件下难以鉴定的微生物类群。Kumar等（2019）采用16S rRNA基因Illumina MiSeq测序技术，对BmBDV感染后48 h、96 h和144 h的家蚕5龄幼虫中肠内容物进行分析，共检测到27门57纲的肠道细菌，并且发现感染可导致144 h时肠道细菌多样性显著降低。该研究进一步发现，BmBDV感染会引发厚壁菌门与变形菌门的丰度比例动态变化，结合qRT-PCR分析证实了肠球菌属丰度与Toll通路基因Bmspz、IMD通路基因BmPGRP-LE的表达水平呈正相关，从而揭示二代测序技术可从菌群-免疫互作层面解析病毒感染的致病机制。

1.6   CRISPR/Cas技术在病原微生物检测中的应用

CRISPR序列最初于1987年被发现（Ishino et al.，1987），并在后续研究中被证实广泛存在于细菌和古细菌中，作为其重要的适应性免疫系统（Marraffini et al.，2010）。根据Cas蛋白的结构和功能差异，CRISPR/Cas系统主要分为两大类。Ⅰ类系统在发挥功能时，依赖多个亚基协同组建效应模块，各亚基分工合作，共同完成对靶标核酸的识别与后续作用；而Ⅱ类系统仅凭借单个多功能的Cas蛋白，便足以精准实现靶标核酸的识别与切割，展现出精简高效的特性（Makarova et al.，2017a；2017b；Koonin et al.，2017）。不同Cas蛋白所具备的特异性酶活性，例如Cas12的反式切割特性，在切割靶标双链DNA后，能激活对体系内单链DNA的无差别降解活性；以及Cas13的RNA靶向能力，可高效识别并作用于单链RNA。正是基于这些特性，CRISPR技术得以从基因编辑领域延伸至分子诊断领域，目前已广泛应用于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）检测（Blanluet et al.，2022；Yang et al.，2022；Yang et al.，2023）、微小RNA（microRNA，miRNA）检测（Zhou et al.，2020；Zhong et al.，2022；Wu et al.，2025；）、核酸检测（Murugan et al.，2017；Aman et al.，2020；Barrangou et al.，2023）、病原感染诊断等多个方面（Chang et al.，2019；Zhu et al.，2022）。

1.6.1   CRISPR/Cas12a系统快速检测技术

CRISPR/Cas12a系统在病原微生物检测中具有独特的分子诊断优势，其技术创新核心在于对双链DNA的精准靶向及高效信号放大机制。该系统的核心效应蛋白Cas12a与Cas12b均含RuvC核酸酶结构域，通过CRISPR RNA（crRNA）引导识别靶标双链DNA，切割后激活反式切割活性，可无差别降解体系内单链DNA报告分子，形成级联信号放大效应（Li et al.，2022）。其中，Cas12b因其在37~52℃宽温区保持稳定活性的显著特性，特别适合与LAMP、RAA等恒温扩增技术联用，极大地推动了CRISPR现场即时检测（POCT）设备的发展。相较于其他CRISPR系统，CRISPR/Cas12a系统的优势显著，其通过双链DNA专一性识别机制有效规避RNA干扰，因此适用于DNA病毒及胞内寄生微生物的检测；在信号放大效率方面，反式切割介导的单链DNA非特异性降解机制构建了级联信号放大路径，大幅提升检测灵敏度。此外，相较于Cas9系统，Cas12a的crRNA成熟无需反式激活CRISPR RNA（Trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA）参与，这不仅简化了操作流程，也为检测方案的多样化设计提供了灵活空间。基于此特性，Zhao等（2023）将重组酶聚合酶扩增（RPA）与Cas12a结合，开发了一种快速检测家蚕微孢子虫的方法，通过重组酶聚合酶扩增（RPA）在等温条件下高效扩增目标DNA，随后充分利用Cas12a蛋白的DNA识别能力以及其非特异性单链DNA切割活性触发信号输出，实现了荧光检测和ICA试纸条双模式检测，其对家蚕微孢子虫基因组的检测下限为2 fg /μL，并且可以成功检测在100粒健康蚕卵里添加低至10²个家蚕微孢子虫，展现出优异的灵敏度和实际应用潜力。为进一步简化流程、避免扩增带来的潜在污染与数据偏差，Zhang等（2024）开发了一种基于多重crRNA引导的CRISPR/Cas12a检测系统。通过设计多个靶向同一DNA序列的互补crRNA，显著增强了Cas12a蛋白的结合与切割效率，从而放大荧光信号。实验数据显示，其检测限低至2 pg，为开发更快速、更简便的现场诊断工具提供了新思路。

1.6.2   CRISPR/Cas13a系统快速检测技术

CRISPR/Cas13a系统属于Ⅵ型CRISPR-Cas系统的Ⅵ-A亚型，为RNA靶向基因编辑工具，其技术特性与Cas12a形成功能性互补，核心在于单链RNA的高特异性识别及信号转换。其作用机制是在crRNA引导下，Cas13a可快速识别互补单链RNA，进而激活顺式切割与反式切割活性（Abudayyehi et al.，2016）。与Cas12a相比，Cas13a靶标类型专一性识别单链RNA，适用于RNA病毒及基因表达产物检测，其反应温度集中于37~42℃，对恒温环境要求严格但无需复杂温控设备，此外信号放大依赖反式切割单链RNA报告分子，效率略低于Cas12a，但RNA靶标特异性更高，交叉反应风险更低。Zhou等（2024）通过结合重组酶聚合酶扩增（RPA）技术和CRISPR/Cas13a系统建立了针对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的可视化快速检测技术，通过RPA高效扩增BmNPV特异性DNA片段，将扩增产物转录为RNA模板，Cas13a-crRNA复合物识别靶标RNA后激活反式切割，降解荧光标记RNA报告分子，最终经侧流层析试纸条或便携式荧光检测器实现信号可视化。该技术对病毒基因组DNA的检测限低至1 fg/μL，对BmNPV阳性标准质粒的检测限达1 copy/μL，且与家蚕其他常见病原体无交叉反应，展现出极高的特异性。试验数据表明，在实测样本检测中，该技术可在感染12 h的家蚕中肠组织及感染3 h的BmN细胞中最早检出BmNPV，而感染72 h后家蚕各组织均能稳定检出病毒，充分验证了其检测准确率。研究证实了该方法兼具灵敏度高、特异性强、检测成本低及可视化便捷等多重优势，已具备在蚕业生产中实现BmNPV现场快速检测的应用价值。

2.   技术转化应用现状

家蚕病原微生物检测技术的研发已取得显著进展，但在产业化程度与应用普及率方面存在明显差异。从技术应用现状来看，传统显微镜检测技术因其设备简单、成本低廉的特点，仍是基层蚕种场母蛾检疫的常规手段，不过，其对人工判读的依赖性以及较低的检测效率，在一定程度上制约了大规模应用。在免疫学检测技术领域，酶联免疫吸附试验（ELISA）凭借较好的灵敏度和定量能力，被广泛应用于蚕种质量监控实验室及部分大型蚕种场，主要用于微孢子虫、病毒等病原的批量筛查；免疫层析技术（ICA）则由于操作简便、20 min内即可得出结果且无需复杂设备，已实现成熟产业化，市场上已出现针对家蚕微粒子病的快速诊断试纸条，以及BmNPV等主要病原的商品化试纸条，在江浙等主蚕区的基层站点和大型养蚕户中普及率较高，成为现场初筛的核心工具。在分子检测技术层面，传统PCR和qPCR作为高灵敏、高特异的“金标准”，主要应用于蚕业科研机构、省级蚕种质量检验检疫中心及大型蚕种场的精准确诊与病原定量分析，其产业化主要体现为专业实验室服务的提供，然而，由于对仪器设备、操作人员及环境要求较高且成本昂贵，难以直接下沉至最基层。环介导等温扩增（LAMP）和重组酶介导等温扩增（RAA）技术因具有恒温反应、设备需求低的特点，被视作极具潜力的现场分子诊断工具，其中，LAMP技术已有部分集成化设备在特定区域试点应用于蚕种微粒子病或病毒的快速筛查，RAA技术则尚处于产业化早期探索阶段。以CRISPR/Cas系统为代表的新一代分子诊断技术，虽在实验室研究中展现出超高灵敏度和快速可视化潜力，但从实验室迈向田间仍面临显著瓶颈：反应体系成本高昂，且需要RPA/RAA预扩增，这增加了操作的复杂性及污染风险；配套便携式一体化检测设备开发滞后，且缺乏适用于蚕业生产场景的标准化、稳定可靠的商业化试剂盒，尚未形成规模化应用。二代测序（NGS）技术主要用于科研层面的病原发现、溯源和微生物群落宏基因组研究，其高通量与高成本特性决定了目前仅局限于科研和高端检疫机构，距离常规生产检测的产业化应用还有一定距离。​

构建“检测技术-防控措施”联动机制，是发挥检测技术核心价值的关键所在。快速检测结果需要即时转化为精准防控决策：当基层站点或养蚕户通过免疫层析试纸条或LAMP快速检测发现疑似BmNPV感染时，可立即隔离病蚕并对蚕室、蚕具进行严格消毒，以遏制病毒扩散；若经qPCR或CRISPR/Cas技术确诊且显示高病毒载量，则需果断淘汰整批蚕种或感染蚕群，防止疫情蔓延。针对微粒子病，在显微镜初检结合免疫层析试纸条或分子检测确诊阳性母蛾或成品卵后，须严格执行蚕种淘汰制度，销毁带毒卵圈。在细菌或真菌病防控中，通过特异性引物的多重PCR或免疫检测快速鉴定病原种类，是指导精准用药的核心，例如，区分苏云金芽孢杆菌感染与其他细菌性败血病，对于前者，无需进行抗菌治疗，只需更换无毒桑叶，对于后者，则针对性选用敏感抗生素，以此避免盲目使用广谱抗生素导致的药物残留和抗药性风险。因此，推动快速、现场化检测技术的普及，并建立配套的标准化、流程化阳性结果响应预案，是实现家蚕病害精准防控、最大限度减少经济损失的核心保障。

3.   展望

蚕桑产业集约化发展导致家蚕病害呈现病原多样性增加、致病机制复杂化趋势。BmNPV等病毒病的高发性、微孢子虫的检疫特殊性、细菌与真菌的抗药性变异等问题，持续威胁茧丝产量与质量。随着技术进步，家蚕病原微生物检测方法不断发展，新型检测设备持续更新，在免疫学、分子生物学及交叉学科领域取得显著突破——不仅能精准鉴定病毒、微孢子虫、细菌、真菌等病原，更在检测灵敏度、特异性、时效性及实用性方面大幅提升。然而，不同检测技术各具优势与适用场景，且存在一定局限：传统镜检依赖人工判读易产生主观性误差，ELISA存在灵敏度瓶颈，PCR对设备依赖性强，CRISPR/Cas系统面临引物设计复杂等问题。因此，实际应用中需依据检测目的选择适配方法：以监测预警为目标时，宜采用免疫层析试纸条、LAMP等简便高灵敏方法进行初筛，严防漏检；以确诊鉴定为目标时，则需借助qPCR、CRISPR/Cas等高精度技术精准区分病原，排除非特异性干扰。同时，NGS、qPCR等分子检测技术因设备成本高、操作门槛高，目前多用于科研及蚕种场高精度检疫，难以在基层养殖场大规模推广。准确高效始终是家蚕病原检测技术发展的核心目标，而“灵敏、快速、简便、智能、经济”则构成未来演进的重要方向。一方面，依托宏基因组测序数据构建病原毒力基因变异数据库，可为高覆盖率、高效率的crRNA探针设计提供数据支持，从而实现病原进化轨迹的动态监测；另一方面，基于微流控芯片平台整合LAMP扩增、CRISPR检测及光学智能读出模块，可开发可视化、一体化的多重病原联合检测系统。此类系统的便携化、自动化升级，将有望打通“桑园-蚕室”全链条的基层应用瓶颈，构建高效、智能的生物安全防控网络，夯实产业可持续发展的技术底座。未来，分子检测与常规检测仍将在家蚕病害防控中发挥互补优势：分子技术凭借其高灵敏度和高特异性，将在提升便携性、降低成本、简化操作流程等方面实现突破，以扩大其在基层场景中的应用；而传统检测手段则需聚焦于结果解读的标准化与检测精度的提升，提升其实用性与可靠性。多技术融合、多层级联动的检测体系将成为推动蚕桑产业高质量发展的关键支撑。