DNA条形码技术是一种依据一段基因片段的序列差异来进行快速区分、鉴定物种的方法。该技术由加拿大圭尔夫大学的Paul Hebert等于2003年提出（Hebert et al.，2003a）。与传统的形态鉴定方法相比，DNA条形码技术不受生物性别、发育阶段的限制以及性状相似性、表型可塑性的影响，不需要具备专业知识的分类学专家就可区分、鉴定物种（Hebert et al.，2003b）。相较于传统形态学分类手段，DNA条形码技术能够实现更迅速、更便捷的生物分类。尤其是在体型较小、种类繁多的昆虫物种鉴定方面，借助DNA条形码可以对卵、幼虫、成虫等处于不同发育阶段的生物个体或死亡个体的残骸进行鉴定，并且不受性别二态性的影响。DNA条形码技术在群居昆虫的物种鉴定中具有明显的优势和应用价值，如蚂蚁和白蚁在群体内往往呈现高度分化的形态特征，仅依靠形态特征容易被错误地鉴定为不同物种（Floyd et al.，2009）。近年来，国内外学者已在不同地区和类群中广泛应用DNA条形码技术开展蚜虫多样性研究。例如，Lee等（2011）对韩国的蚜虫群落进行条形码分析，发现多种形态上难以区分的种群存在显著的遗传分化。然而，目前关于内蒙古地区蚜虫条形码数据库的研究相对匮乏，尚缺乏大范围系统性采样与序列分析的报道。

蚜虫类Aphidinea隶属于昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera，共包含3科25亚科，世界已知5 300余种（Favret，2025），中国共记录260余属约1 200种（刘征，2009）。蚜虫是对农林牧业以及园艺生产构成严重威胁的一类害虫。它们通过吸取植物韧皮部汁液导致植物受损，造成叶片卷曲、生长畸形等。牧草在受到蚜虫侵害后生物量和营养价值会显著降低，从而影响牲畜的饲料供给质量（Blackman & Eastop，2000）。蚜虫还是多种植物病毒的传播媒介。例如，蚜虫能够传播黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDVs）等重要植物病毒，导致植物叶片卷曲、变色、矮化等，进而影响植物的正常生长发育，严重降低农作物的产量和品质。此外，蚜虫在取食过程中分泌的大量黏稠蜜露会覆盖在植物叶片和茎部表面，阻碍植物的气体交换和光合作用，影响植物对养分的合成和积累。蜜露还为真菌和细菌的生长提供了适宜环境，可诱发黑霉病等病害，造成植株叶片脱落、枝条干枯甚至整株死亡。因此，蚜虫的暴发将对农林牧业和园艺业带来重大威胁，造成不可估量的经济损失。然而，蚜虫的繁殖速度极快，能够在短时间内形成大规模虫害，增加了病虫害防治的难度（姜立云等，2011）。在内蒙古地区，蚜虫危害具有明显的区域性与宿主特异性。呼和浩特地区蚜虫田间为害状况调查显示，马铃薯田的优势物种为桃蚜Myzus persicae和棉蚜Aphis gossypii，其种群密度与季节性变化明显，空间分布呈聚集格局（卜庆国等，2013）。内蒙古草地与农田交错区的蚜虫群落结构与寄主关系复杂，表明在该区开展基于分子与形态证据的物种鉴定与监测具有现实意义与应用价值。因此，准确快速地进行蚜虫物种鉴定，对于有效开展精准害虫防控十分关键。

内蒙古位于中国北部边境，位于37~53°N至96~126°E之间，北与蒙古国接壤，南接华北平原，总面积约118.3万km²，占全国国土总面积的12.3%。该地区的地形特点是“南高北低、东高西低”，沙地、草原、林地等地形变化很大。内蒙古地处干旱和半干旱气候区，年降水量少，蒸发量高，沙风天气频繁（Li et al.，2025）。内蒙古的气候特点孕育了丰富多样的植被类型，包括草原、灌木丛以及零星分布的森林。其中，草原是该地区最主要的植被类型，覆盖面积约占全区总面积的80%。组成草原植被的种类繁多，以禾本科Poaceae、豆科Fabaceae和菊科Asteraceae植物为主，例如针茅Stipa capillata、羊茅Festuca ovina、紫花苜蓿Medicago sativa和苦荬菜Ixeris polycephala等。这些植物不仅适应干旱寒冷的气候条件，还在维持生态系统稳定性和支持草原牧业发展方面发挥着重要作用（Bai et al.，2008）。

内蒙古复杂多样的生态系统为蚜虫的生存繁衍提供了丰富的栖息环境。区域内多样的植被类型构成了蚜虫丰富的食物来源，成为蚜虫物种多样性的重要支撑。蚜虫对寄主植物具有较强的专一性或偏好性，不同蚜虫物种在其演化过程中形成了对特定植物种类的依赖，这种寄主选择在很大程度上影响了蚜虫的分布格局（Dixon，1998）。在内蒙古，禾本科和豆科等主要植物类群均是多种蚜虫的重要寄主植物。蚜虫对不同寄主植物的适应不仅反映了其生态位分化，也为研究其多样性格局提供了生态学依据（Blackman & Eastop，2000）。张斌（2014）对内蒙古地区的蚜虫种类开展了初步分类学研究，共记述3科14亚科104属280种。由于蚜虫的生活史复杂，部分种类具有孤雌生殖、季节型变换及寄主转换等生物学特性，导致同一物种不同生活型之间的形态差异显著，蚜虫分类学专家之外的相关人员仅依据形态特征差异难以高效鉴定到物种（Le Trionnaire et al.，2009；Emmanuelle et al.，2010）。因此，在内蒙古地区开展基于DNA条形码的蚜虫物种鉴定研究，科学、精准地识别蚜虫物种，不仅是填补区域研究空白的重要一步，还能够深化对该地区生态系统的认知，为农林牧业生产中的害虫监测与综合治理提供数据支持。

1.   材料与方法

1.1   标本采集

本研究标本采集地点包括呼和浩特市、鄂尔多斯市、阿拉善盟、阿尔山市、赤峰市、呼伦贝尔市、乌兰察布市、包头市、通辽市等。蚜虫采集以直接采集法为主，共获得175号样品，采集信息详见网络版增强出版材料附表 1。蚜虫样品分别以75%和95%酒精溶液浸泡，并置于-30℃冰箱保存。以75%酒精浸泡样品制作玻片标本用于形态学研究，95%酒精浸泡样品用于分子生物学实验。所有样品均存放于中国科学院动物研究所国家动物标本资源库（中国，北京）。

1.2   形态学鉴定

基于Remaudière和Remaudière（1997）蚜虫分类系统，对照文献描述和定名标本，依据标本形态特征完成物种鉴定。每号样品选取个体完整的无翅孤雌蚜制作成玻片标本，鉴定工作由乔格侠研究员镜检完成（显微镜Leica 2500）。经形态学鉴定，本研究所有样品共涉及蚜虫40属61种（详见网络版增强出版材料附表 1）。

1.3   DNA提取、PCR扩增和测序

使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）提取单头蚜虫个体的基因组DNA。采用通用引物LepF（5'-ATTCAACCAATCATAAA GATATTGG-3'）和LepR（5'-TAAACTTCTGGAT GTCCAAAAAATCA-3'）（Foottit et al.，2008）进行COI片段序列扩增。扩增体系为25 μL，包括：18.2 μL DDW、2.5 μL 10×PCR Easy Taq Buffer、0.3 μL Easy Taq DNA聚合酶、1 μL dNTPs、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、2 μL DNA模板。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终延伸10 min。在GeneAmp PCRSystem 9700基因扩增仪（Applied Biosystem，USA）上进行PCR反应，所有样品均成功获得COI片段，PCR扩增成功率为100%。PCR产物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行琼脂糖凝胶电泳检测、纯化和测序。

1.4   序列分析与系统发育树构建

使用DNASTAR软件包中的Seqman 12.3拼接双向测序所得的正反向序列，辅助以人工校对。利用DNAMAN 5.2.2软件检验拼接后的序列是否能正确翻译为蛋白质，以确保序列的正确性。所有序列已上传至GenBank（登录号见网络版增强出版材料附表 1）。使用MEGA11软件中集成的MUSCLE算法进行多重序列比对（Edgar，2004；Tamura et al.，2021），分析序列特征，基于Kimura 2-Parameter（K2P）双参数模型计算种内和种间遗传距离，并采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，检验支持率的重复性抽样次数为1 000次。

1.5   物种界定分析

本研究采用基于遗传距离分类的自动条形码间隙发现法（Automatic barcode gap discovery，ABGD）与自动分组物种界定（Assemble species by automatic partitioning，ASAP）、基于系统发育关系分类的广义混合Yule溯祖模型（Generalized mixed Yule coalescent，GMYC）、泊松树进程（Poisson tree processes，PTP）与贝叶斯泊松树进程（Bayesian Poisson tree processes，bPTP）共5种方法利用COI序列进行分子物种界定。

ABGD：基于网页版软件（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html）运行。计算参数设置如下：Pmin = 0.001（最小距离阈值），Pmax = 0.055（最大距离阈值），Steps = 10（Pmin和Pmax之间的步数，表示在计算中将使用多少个不同的距离值）；X（relative gap width）=1.0（种群内与种群间变异的界限）；碱基替换模型使用Kimura（K80）。

ASAP：采用在线分析（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/#），使用Kimura（K80）ts/tv模型。参数设置如下：Probability = 0.01；Keep Best scores = 10（显示前10个最佳物种界定方案）；Fixed seed value（随机数种子）= 66。

GMYC：首先使用DnaSP v6.12.03（Librado & Rozas，2009）进行单倍型分析。基于COI单倍型序列使用BEAST v2.7.4构建超度量二歧分支树，选择宽松分子钟，MCMC链为30 000万代，每3万代抽样一次，使用Tracer vl.7.2（Rambaut et al.，2018）评估收敛情况，设置Burn-in为20%。将树文件导入Tree Annotator v1.10.4生成所需系统树，使用R语言SPLITS包进行GMYC分析。

PTP与bPTP：首先使用RAxML v1.2.0（Stamatakis，2006）基于GTRCAT模型，利用COI单倍型序列构建最大似然树。所得树文件上传至PTP在线分析平台（https://species.h-its.org/ptp/）进行物种划分分析。在该平台上分别运行PTP（最大似然模式）和bPTP（贝叶斯模式）。其中，PTP模式设置MCMC迭代次数为100 000代，Thinning（抽样间隔）为100，Burn-in为10%；bPTP模式设置MCMC迭代次数为500 000代，其他参数保持默认。最终同时获得PTP（ML）与bPTP（BI）两种结果。

2.   结果与分析

2.1   基因序列特征

本研究共获得内蒙古地区蚜科和球蚜科共2科40属61种蚜虫175号样品的COI片段序列175条，序列长度为658 bp。其中包含399个保守位点、259个可变位点和253个简约信息位点。T、C、A、G的平均含量分别为40.4%、14.6%、34.7%和10.3%，具有显著的AT偏好性。

2.2   遗传距离

基于COI基因序列计算了内蒙古地区蚜虫各属的种内及种间遗传距离（表 1）。各属的平均种间遗传距离为5.96%~13.94%，平均种内遗传距离为0~1.57%，表现出较高的平均种间遗传距离和较低的平均种内遗传距离。各属的最小种间遗传距离为1.57%~9.70%，最大种内遗传距离为0~4.60%。蚜属Aphis中，艾蚜Aphis kurosawai与甜菜蚜Aphis fabae的最小种间遗传距离较低，仅为1.57%；酸模蚜Aphis rumicis的最大种内遗传距离4.60%。除蚜属以外的类群，最小种间遗传距离均大于最大种内遗传距离，表明COI条形码序列可有效鉴别内蒙古地区的蚜虫物种。

2.3   系统发育树

基于所有175号样品的COI序列所构建的NJ树中（详见网络版增强出版材料附图 1），每个物种形成独立分支，对于具有多号样品的物种其所有样品均聚类形成高支持率的单系群，与形态鉴定结果完全一致。

2.4   物种界定

ABGD划分结果包含初始化分（Initial partition）和递归划分（Rescursive partition），后者在初始划分的基础上进一步分析组内数据是否存在更小的分类单元。当P值在0.0226~0.0352范围内，递归划分结果稳定，将175号蚜虫样品划分为61个分子操作分类单元（Molecular operational taxonomic unit，MOTU）（图 1），均对应既定的形态学物种（详见网络版增强出版材料附图 1）。

图  1  基于COI序列的内蒙古蚜虫ABGD划分结果

注：不同颜色代表ABGD方法中不同先验值（P）下MOTU数量的变化。

Fig.  1  Partitioning results of aphids from Inner Mongolia by ABGD based on COI sequences

Note: Different colors represented the variation in the number of MOTUs under different prior values (P) in the ABGD method.

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ASAP前10个最佳划分结果如表 2所示，得分为8.00~22.00，MOTU数量为60~99个。得分越低的分组结果越优，当得分为8.00时将所有蚜虫样品划分为60个MOTU。与形态鉴定结果进行比较，发现ASAP将茄粗额蚜Aulacorthum solani和麦无网蚜Metopolophium dirhodum划分为一个MOTU，其他物种与形态鉴定结果一致（详见网络版增强出版材料附图 1）。

GMYC分析共得到65个MOTUs，将豆蚜、红花指管蚜Uroleucon gobonis、桃粉大尾蚜Hyalopterus arundiniformis与库多态毛蚜Periphyllus kuwanaii各自划分为多个MOTUs（详见网络版增强出版材料附图 1）。

PTP和bPTP分析均得到61个MOTUs，但与形态鉴定结果存在一定偏差（详见网络版增强出版材料附图 1）。两种方法均将水蒿小长管蚜Macrosiphoniella kuwayamai划分为2个MOTUs，而将豆蚜和大巢菜蚜归为1个MOTU。

3.   结论与讨论

本研究对内蒙古地区40属61种蚜虫，利用COI序列，通过计算遗传距离、构建系统发育树并结合多种物种界定方法，进行DNA条形码鉴定。除蚜属以外，各属的最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离，存在DNA条形码间隙（DNA barcoding gap），蚜属中酸模蚜遗传距离过大的原因可能是样品分别采自贺兰山和呼和浩特两个不同地理种群，其中可能存在物种分化，有待后续进一步研究。NJ树与ABGD的划分结果与形态学分类结果一致。采自不同地点、不同寄主植物的同一物种样品在NJ树中稳定地形成单系分支，并且在ABGD分析中被归为同一个MOTU，表明DNA条形码技术能够有效鉴别内蒙古地区的蚜虫物种。

ASAP、GMYC、PTP和bPTP方法分别将61种175号蚜虫样品划分为60、65、61和61个MOTU，其中分别有59、57、58和58个MOTUs与形态鉴定结果一致。5种分子物种界定方法的鉴定准确率分别为：ABGD（100%） > ASAP（96.72%） > PTP、bPTP（95.08%） > GMYC（93.44%）。

不同物种界定方法的结果差异主要集中在对个别蚜虫物种的鉴别效力不同（详见网络版增强出版材料附图 1）。ABGD物种界定结果与形态鉴定高度一致，该方法通过自动检测条形码间隙将序列划分为“候选物种”（Puillandre et al.，2012）。Zhu等（2017）对毛蚜亚科Chaitophorinae蚜虫物种的DNA条形码研究中同样发现，ABGD显示出最强的物种界定能力。

茄粗额蚜和麦无网蚜之间的遗传距离为3.69%，而ASAP将二者归为了同一个MOTU，这可能是由于ABGD通过检测遗传距离分布中的条形码间隙来初步划分物种。而ASAP则在全距离矩阵上系统扫描所有可能的分割方案，通过优化ASAP-score选择组内一致性最高、组间分离度最大的划分方案，从而实现自动化物种划分（Puillandre et al.，2021）。由于茄粗额蚜与麦无网蚜遗传差异相对较小，ASAP在优化分区得分时可能将二者合并为同一MOTU。当物种分化较快、种群规模较大或不均衡以及取样不足时，GMYC法容易导致物种的过度划分（Esselstyn et al.，2012；Fujisawa et al.，2013）。本研究中，GMYC法在处理豆蚜、红花指管蚜、桃粉大尾蚜与库多态毛蚜时就出现了过度划分的情况。PTP方法基于系统发育树的分支长度来估算物种的分化事件；bPTP则在PTP的基础上引入贝叶斯推断框架，借助节点支持率进一步提高了对物种分化模式的识别能力（Zhang et al.，2013）。这两种方法都将遗传距离为1.72%的2号水蒿小长管蚜样品划分为2个MOTU，虽然PTP和bPTP方法并不考虑遗传距离，但是高突变率同样可能导致PTP和bPTP模型出现过度划分的问题（Dellicour & Flot，2018）。与此同时，低突变率则可能导致两种方法将种间遗传距离较小的不同物种视为同一物种，如本研究中PTP和bPTP将豆蚜和大巢菜蚜归为同一MOTU。

综上所述，DNA条形码技术能够有效应用于内蒙古地区蚜虫物种的快速鉴定。不同物种界定方法的效力有所不同，其中ABGD效力最佳。在实际应用中，应采用多种方法进行综合考虑。同时，将分子物种界定与形态鉴定相结合可以有效提高蚜虫物种的鉴定效率和准确性。

COI标记在大多数地区常见的蚜虫及其他昆虫的物种鉴定中基本能够满足需求，对于绝大多数物种能够提供可靠的分辨能力（Jung et al.，2011；Coeur d’Acier et al.，2014；Posada-López et al.，2023）。本研究的蚜虫物种鉴定主要基于COI单基因序列。鉴于在快速演化的类群（如蚜属、长足大蚜属Cinara和毛蚜属Chaitophorus）中依据单独分子标记进行DNA分类可能出现分子和形态鉴定结果不完全一致的情况，建议补充多基因序列和增加样品数量进行分析，以提高蚜虫物种鉴定的准确性与可靠性。

附录：附表 1本研究所用的内蒙古蚜虫样品信息

附图 1 不同方法对内蒙古地区蚜虫的物种界定结果

详细数据见网络版增强出版材料（http://hjkcxb.alljournals.net/）

附图 1  不同方法对内蒙古地区蚜虫的物种界定结果

注：基于COI条形码序列构建的NJ树（比例尺表示序列遗传距离0.01次碱基替换/位点），节点处数字为自助法支持率（bootstrap support）≥50%显示。右侧依次展示ABGD、ASAP、PTP、bPTP、GMYC以及基于传统形态学鉴定的物种划分结果。

Appendix Fig. 1  The species delimitation results of aphids in Neimenggu using different methods

Note: The NJ tree was constructed based on COI barcode sequences (the scale bar indicates the genetic distance, 0.01 substitutions per site). Numbers at the nodes represent bootstrap support values (≥50% are shown). Species delimitation results inferred by ABGD, ASAP, PTP, bPTP, GMYC, and traditional morphological identification are displayed on the right.

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