2003年，Hebert等（2003）通过比较动物界11个门类共13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI-5′）序列，提出可利用一段短标准基因片段作为物种的分子标识，实现对全球生物的编码，即DNA条形码（DNA barcoding）。该技术借鉴了超市中通过扫描条形码区分商品的思路，旨在利用一段标准化的DNA序列实现物种的快速识别与鉴定。生命条形码联盟（Consortium for the Barcode of Life，COBL；http://www.barcodeoflife.org/）将DNA条形码定义为：能够对物种进行高效鉴定的短标准DNA片段。除COI基因外，常用的条形码片段还包括COⅡ（Cytochrome c oxidase subunit Ⅱ）、Cytb（Cytochrome b）、16S rDNA、ITS1（Internal Transcribed Spacer 1）、ITS2（Internal Transcribed Spacer 2）、EF-1α（Elongation Factor-1α）和28S rDNA等（Kress and Erickson, 2012）。理想情况下，通过将未知样本的序列与参考数据库中的已知序列进行比对，即可实现快速物种鉴定。然而实际应用中，参考数据匮乏以及序列鉴定错误等因素，往往显著影响物种鉴定的准确性与可靠性（Ma et al., 2022）。

除物种快速鉴定外，基于COI基因的DNA条形码技术还广泛应用于物种界定（Song et al., 2018；Ge et al., 2021；Li et al., 2023）、隐存种发现（Hebert et al., 2004；Kanturski et al., 2018）及生物多样性评估（Lopez-Vaamonde et al., 2021；Chimeno et al., 2022）。此外，该片段也可为近缘物种间的系统发育关系推断提供有效参考（Rosas et al., 2011；Gomez et al., 2018）。尽管国内相关研究起步相对较晚，但众多学者已在多个类群中构建了较高质量的DNA条形码数据库，并在物种界定等方面取得了显著进展（见表 1）。

象虫总科（Curculionoidea）是昆虫纲鞘翅目中最多样化的一个类群。目前，全世界已经记述7科5 800余属62 000余种（Oberprieler et al., 2007），中国3 500余种（Alonso-Zarazaga et al., 2023）。该类群成虫最显著的形态特征为头部向前延伸呈象鼻状的“喙”，以及外咽片消失、外咽缝愈合为一条单一缝（赵养昌和陈元清，1980）。象虫总科食性广泛，可取食蕨类、裸子植物和被子植物（Oberprieler et al., 2007），其中多种为重要的经济害虫。例如，甜菜象Bothynoderes punctiventris Germar与黑甜菜象B. libitinarius Faust严重危害甜菜的子叶期和苗期（王念平和唐邦春，2021），被视为甜菜生产上的毁灭性害虫（赵养昌和陈元清，1980）。木蠹象属Pissodes Germar则主要危害松属Pinus、云杉属Picea及冷杉属Abies等针叶树种（吕秀霞和张润志，2007；张新民等，2022），部分物种被列为中国禁止进境的检疫性有害生物（张润志和任立，2020）。茶丽纹象Myllocerinus aurolineatus Voss取食茶叶，是茶园重要的食叶性害虫之一（陈李林等，2024）。因此，实现对象虫物种的快速、准确鉴定，对农林业生产安全及进出境检疫工作具有重要指导意义。

DNA条形码技术是实现象虫物种快速鉴定的有力工具。但迄今为止，我国在象虫总科层面尚缺乏大规模、系统化的DNA条形码数据库，相关研究仅见于青藏高原喜马象属团（Ren et al., 2024）。为填补这一空白，本研究通过整合公共数据库资源及新生成的COI-5′序列，初步构建了一个覆盖中国象虫总科的条形码数据集，以期为该类群的物种鉴定与系统学研究提供标准化的参考依据。

1.   材料和方法

1.1   样本采集与鉴定

本研究所用样本主要由作者及研究组成员在西藏、云南、内蒙古等地区的野外采集。野外采集的标本均立即保存于无水乙醇中，并同步记录采集地点、经纬度、海拔、采集人、采集时间及寄主等信息。返回实验室后，首先依据形态特征对标本进行初步分类，再参考《中国经济昆虫志第二十册鞘翅目象虫科（一）》进行物种鉴定，并依据《Cooperative catalogue of Palaearctic Coleoptera Curculionoidea》更新分类信息（Alonso-Zarazaga et al., 2023）。留存凭证标本后，其余标本更换无水乙醇，置于-40℃冰箱中冻存，以备后续分子实验使用。

1.2   DNA提取和COI基因扩增

使用DNeasy Blood & Tissue Kits试剂盒提取样本DNA。采用通用引物LCO1490（GGTCAACAAA TCATAAAGATATTGG）和HCO2198（TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA）对COI基因片段进行PCR扩增（Folmer et al., 1994）。PCR反应体系总体积为25 μL，包括：12.5 μL 2 × MasterMix、8.5 μL ddH₂O、正反向引物各1 μL，以及2 μL DNA模板。扩增程序设置为：94℃预变性2 min；随后进行5个循环：94℃变性40 s，45℃退火40 s，72℃延伸60 s；继续35个循环：94℃变性40 s，51℃退火40 s，72℃延伸60 s；最后72℃延伸5 min，4℃保存（Ma et al., 2022）。PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序部进行双向测序。

使用DNASTAR Lasergene SeqMan v 7.1.0软件（DNASTAR Inc.，USA）检查测序峰图质量，核对并修正正反向序列不一致的碱基，切除两端引物区域，剔除质量不佳的序列并重新进行扩增与测序（Burland，2000）。将处理后的序列导入MEGA v7.0软件进行多重序列比对，并依据无脊椎动物密码子表翻译为氨基酸序列以检测是否存在终止密码子（Kumar et al., 2016）。最后，将序列在NCBI BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行比对，排除非象虫来源的COI基因序列。

1.3   数据整合和系统发育分析

由于BOLD（Barcode of Life Data System，https://www.boldsystems.org/）数据库中包含大量已上传的凭证标本信息，有助于序列验证，因此本研究从该数据库中获取了相关序列（截至2025年8月）。序列筛选标准如下：（1）样本采集自中国；（2）序列标记为COI-5′；（3）序列长度介于600~700 bp之间；（4）简并或缺失碱基的比例低于5%。筛选后的序列与1.2节中获得的自行测序序列合并，使用MEGA v7.0进行多重序列比对，并对序列两端进行修剪。

基于赤池信息准则（Akaike information criterion，AIC），通过IQ-TREE网络服务器（http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/）选取了最优核苷酸替代模型（GTR + F + I + G4），并采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）构建系统发育树，其余参数保持默认设置（Trifinopoulos et al., 2016）。

2.   结果与分析

2.1   DNA条形码数据集物种组成

本研究构建的中国象虫总科DNA条形码数据集共包含571个物种、1 868条序列，约占中国已知象虫总科物种数的七分之一（Alonso-Zarazaga et al., 2023）（图 1，图 2）。数据来源方面，实验室自测的序列涵盖333个物种、1 459条序列，分别占数据集物种总数和序列总数的58.3%和78.1%；而从公共数据库（主要为BOLD数据库）筛选获得的序列共涉及241个物种、409条序列（见网络版增强出版材料附表 1、附表 2）。物种数量虽较为可观，但序列数量明显少于自测部分，反映出我国象虫总科DNA条形码在公开数据库中仍较为匮乏。分类组成方面，数据集覆盖象虫总科5个科。其中，象虫科（Curculionidae）的物种数（483种，占84.7%）和序列数（1 691条，占85.9%）均占绝对优势，构成数据集的主体；毛象科（Nemonychidae）仅包含1个物种、5条序列，物种与序列数量均为最少。数据比例与象虫总科的实际物种组成比例基本一致：象虫科本身即为该总科中最大的科（约占82.3%），而毛象科已知种类较少，仅76种（Oberprieler et al., 2007）。

图  1  数据集物种和序列组成

注：内环表示物种，外环表示序列。图中物种分别为：Cimberis elongata (LeConte), Nemonychidae; Arrenodes minutus (Drury), Brentidae; Allandrus bifasciatus Leconte, Anthribidae; Merhynchites bicolor (Fabricius), Attelabidae; Ericydeus lautus (LeConte), Curculionidae。物种图片来自于https://bugguide.net。

Fig.  1  Composition of species and sequence data

Note: The inner ring represents species, and the outer ring represents sequences. The species shown in the figure are: Cimberis elongata (LeConte), Nemonychidae; Arrenodes minutus (Drury), Brentidae; Allandrus bifasciatus Leconte, Anthribidae; Merhynchites bicolor (Fabricius), Attelabidae; Ericydeus lautus (LeConte), Curculionidae. Species images from https://bugguide.net.

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图  2  系统发育分析

注：蓝色、黄色、绿色、紫色、红色分别代表象虫科、锥象科、长角象科、毛象科和卷象科。

Fig.  2  Phylogenetic analysis

Note: Blue, yellow, green, purple and red respectively represent the Curculionidae, Brentidae, Anthribidae, Nemonychidae, and Attelabidae.

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2.2   DNA条形码数据集物种分布

本研究构建的DNA条形码数据集中样本主要采集自西藏自治区、云南省和四川省，三地贡献的物种合计占比超过八成（图 3，表 2）。其中，西藏与云南两地的物种占总数三分之二以上（71.1%），四川亦贡献了较多物种（10.2%）。这些区域是青藏高原的重要组成部分，其境内的喜马拉雅山脉和横断山脉属于全球生物多样性热点地区，因此获得了更多的研究关注与采样投入。其中西藏的突出贡献直接得益于2018至2022年间，本团队依托《青藏高原第二次综合科学考察》项目所开展的系统性野外工作及后续大规模的DNA条形码测定。尽管本研究数据已覆盖全国15个省级行政区，但对西北和东北等地区的采样仍有待补充。

图  3  数据集物种分布

注：该图基于国家基础地理信息中心天地图服务中心下载的审图号为GS (2024) 0650号的标准地图制作，底图无修改。

Fig.  3  Distribution of species in the dataset

Note: This map is based on the standard map with the review number GS (2024) 0650, downloaded from the Map World Service Center of the National Geomatics Center of China, and the base map has not been modified.

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2.3   DNA条形码数据集物种鉴定情况

数据集序列的鉴定深度存在一定差异（图 4）。总体来看，能够鉴定到种和属的物种分别为103种（18.1%）与192种（33.7%），二者合计占比超过一半。另有较大比例的物种仅鉴定至亚科（104种，18.2%）或科（112种，19.6%）一级。从数据来源看，自测数据中鉴定到种的比例（82种，24.6%）高于数据库来源的数据（25种，10.5%）。不过，两者在“种+属”层级的鉴定总比例较为接近，分别为55.5%（自测）与50.2%（数据库）。此外，数据库数据中鉴定至科水平的比例较高（112种，47.1%），而自测数据中则以鉴定至亚科的比例较高（125种，37.5%）。

图  4  数据集物种鉴定情况

Fig.  4  Species identification of the dataset

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3.   结论与讨论

本研究通过自测COI条形码并结合在线数据库（BOLD）的数据，初步构建了一个涵盖中国象虫总科5个科、571个物种、1 868条序列的条形码数据集。其中，自测序列共计1 459条，涉及333个物种，构成数据集的主体。物种组成方面，象虫科的物种数和序列数均为最多。数据集中的样本来源于全国15个省级行政区，其中以青藏高原地区的物种最为丰富。物种鉴定方面，整体上能够鉴定到种的序列不足五分之一，但自测数据中鉴定到种的比例相对更高。

DNA条形码技术已在生产实践中展现出重要应用价值。例如，孙佳琦等（2024）通过扩增COI条形码并与NCBI数据库中的序列进行比对，成功鉴定了豆科绿肥作物紫云英上的关键害虫——苜蓿叶象Hypera postica（Gyllenhal）。陈俊杰（2022）通过构建昆嵛山鞘翅目昆虫的DNA条形码数据库，实现了对象虫总科52个物种的准确鉴定。吴芳等（2021）的研究也表明，基于COI基因可有效区分三种重要仓储害虫：米象Sitophilus oryzae（Linnaeus）、玉米象S. zeamais（Motschulsky）和谷象S. granarius（Linnaeus）。在板栗种植中，栗雪片象Niphades castanea Chao与栗实象Curculio davidi Fairmaire的幼虫形态相似难以区分，但肖云丽等（2017）借助COI条形码实现了二者的可靠鉴别。Yang等（2021）通过COI序列比对，克服了幼虫和蛹阶段的形态鉴定困难，确定了一种危害栎树的新害虫——多斑柞跳象Rhynchaenus maculosus Yang et Zhang。此外，Ren等（2024）还构建了青藏高原特有类群喜马象属团的DNA条形码数据库，为该类群的物种界定和隐存多样性研究提供了重要工具。通过对COI条形码遗传距离的分析，Ma等（2022）认为在粗喙象亚科水平上的物种划分阈值为9.18%。这些研究进一步凸显了完善DNA条形码数据库的必要性。此外，来自欧洲等地的大规模DNA条形码数据库在生物多样性评估等工作中也发挥了重要作用（Hendrich et al., 2015；D’Ercole et al., 2021；Lopez-Vaamonde et al., 2021；Chimeno et al., 2022）。

尽管如此，国内在象虫总科DNA条形码数据库建设方面仍相对滞后。本研究构建的数据集可视作该领域的一项基础性工作。尽管所包含的物种数量较为可观，但与全国已记录的象虫总科物种相比（Alonso-Zarazaga et al., 2023），其覆盖率仍显不足。相比之下，草蛉科的DNA条形码数据库已覆盖我国25个省级行政区，包含85.0%的属和43.6%的物种（Lai et al., 2024）；而欧洲（Dincă et al., 2021）与美洲（D’Ercole et al., 2021）的蝴蝶DNA条形码数据库更是分别涵盖了当地97.0%和96.0%的物种，显示出极高的完整度。此外，区域采样力度存在明显不平衡。在《青藏高原第二次综合科学考察》项目的支持下，本研究对该区域的象虫类群开展了系统性调查。仅第一作者在青藏高原考察累计达160余天，所获物种数量远超其他地区。相比之下，数据集中仅收录2个来自山东省的物种，而仅烟台市昆嵛山地区就分布有至少52个物种（陈俊杰，2022），反映出该地区的采样投入远不及青藏高原。同时，不同地理种群的覆盖也较为有限。以沟框象Eucryptorrhynchus scrobiculatus（Motschulsky）为例，其已知分布范围包括北京、天津、山东、陕西、山西、上海、湖北和四川等地（赵养昌和陈元清，1980），但数据集中仅收录了来自北京的种群。最后，数据集中仅约半数物种鉴定到种或属水平。鉴定信息不完整可能直接导致物种鉴定困难或结果误判（Moraes et al., 2024），从而进一步限制了该数据库的实际应用潜力。

本研究仅关注COI序列，未分析其他类型的DNA条形码，这可能在一定程度上低估了象虫类群的数据丰富度，但实际影响十分有限。以象虫科为例，在BOLD数据库中检索（截至2026年5月28日），共获得142 182条序列记录，其中COI-5′序列为130 548条，占比高达91.8%。类似地，卷象科、长角象科和锥象科中COI-5′序列的占比分别为92.7%、99.1%和94.7%。这些数据进一步表明COI序列在象虫总科中具有广泛的普遍性和良好的代表性。然而，由于COI序列长度有限、携带的系统发育信息相对不足，仅凭该片段进行系统发育分析可能效果不佳。例如，本研究所构建的系统发育树中，毛象科的序列并未形成单系，而是嵌套在长角象科内部。这一现象或许反映出二者亲缘关系较为接近，已有的系统发育基因组学研究也已证实，毛象科与长角象科互为姊妹群（Shin et al., 2018）。

基于本研究构建的数据集，未来可在以下几个方面持续推进：鉴于象虫总科具有物种多样性高、分布广的特点，以及中国幅员辽阔的客观现实，全面采样仍是当前面临的首要挑战。在物种与地理覆盖方面，建议优先关注物种丰富度高但现有采样严重不足的区域（如华中、华南等地），系统提升数据库在物种与空间层面的代表性。同时，应积极推动各地高校与科研机构之间的协作，充分利用馆藏标本资源，从中获取稀有物种及难以重新采集类群的DNA条形码序列，填补关键类群的数据缺口。在物种鉴定方面，需加强分类学人才的培养与储备，整合形态学与分子数据进行综合鉴定，以提高效率。例如，结合COI-5′序列与形态特征，我们发现了中国宽沟象属（Pachynotus）的一个新物种——长毛宽沟象Pachynotus pilosus（Ren et al., 2024）。类似地，笔者还在喜马象属（Leptomias）中发现了7个新物种，目前正在准备发表。这些案例充分体现了DNA条形码技术的高效性，显著减轻了分类学的压力。

附录：附表 1本研究筛选数据库序列情况

附表 2本研究采集物种信息

详细数据见网络版增强出版材料（http://hjkcxb.alljournals.net）