尼古丁（Nicotine）由1个氢化吡咯烷环和1个吡啶环构成的生物碱，是烟草中含量最高的生物碱，约占烟草总生物碱含量的95%（Jiang et al.，2023）。由于自然气候条件、土壤、施肥和烟叶部位等因素的差异，在烟草中会产生烟碱含量偏高的烟叶，其含量可达烟叶干质量的6%。我国每年都生产大量高烟碱烟叶，严重影响了烟叶的吸味品质（陈晨等，2019；Zhang et al.，2024）。目前，烟叶中尼古丁含量偏高已成为制约我国烟草质量的主要因素之一（李晓华等，2017）。此外，在卷烟加工过程中产生的碎烟梗、碎烟末以及污水等烟草废弃物中，均含有较高浓度的尼古丁。在烟草种植和生产过程中，尼古丁会随着雨水渗透到地下，污染水体。尼古丁还能够轻易穿越生物膜和血脑屏障，并对人体的组织和细胞造成损害（李存琪等，2019；郑秀成等，2020）。因此，1999年，欧盟首次将烟草废弃物列为“有毒和危险废弃物”（Tang et al.，2011；Wang et al.，2023）。目前，降低尼古丁含量的技术大致可分为三类：农业技术、物理化学技术和微生物技术（Li et al.，2021）。由于农业技术存在育种时间长、操作繁琐等问题，物理化学技术的处理成本高且对环境有害。因此，利用微生物降解烟碱是降低烟叶和环境中尼古丁含量的具有前景的新途径之一（Tang et al.，2011；Wang et al.，2021）。

微生物是自然界中的重要分解者，代谢方式多样，种类繁多，繁殖速度快。它们在土壤微生态修复、土壤质量改良和尼古丁降解等方面具有重要的潜在应用价值，展现出高效率、低污染和可持续性的特点（祁国振等，2016；李苏洁等，2022）。目前，降解尼古丁的微生物主要包括假单胞菌属Pseudomonas sp.、节杆菌属Arthrobacter sp.、土壤杆菌属Agrobacterium sp.、Shinella sp.、中间苍白杆菌属Ochrobactrum sp.、红球菌属Rhodococcus sp.以及米曲菌Aspergillus oryzae等（万虎等，2009；苏丹等，2021；Wen et al.，2023；Zhang et al.，2024），这些微生物将尼古丁作为它们唯一的碳源和氮源。然而，目前对众多微生物在长期连作的烟草尼古丁代谢途径中所起的作用了解仍然有限，这阻碍了烟草废物处理和烟草尼古丁利用新技术的发展。此外，关于根癌农杆菌对尼古丁的分子降解机制的相关研究较少。目前的研究主要集中在其作为基因工程载体介导烟草转化，而涉及其形态鉴定及对烟碱的降解效率和降解机制的文献相对较少。陈晨等（2012）分离出具有降解烟叶中烟碱能力的根癌农杆菌528。孔雯分离鉴定了根癌农杆菌BKCER11，其在烟碱降解方面的最适条件为：温度为30℃，烟碱初始浓度为2 g/L，pH为5.5~6.0，降解率达到96.63%（孔雯，2011）。根癌土壤杆菌A. tumefaciens SCUEC1菌株具有较强的尼古丁降解能力，尼古丁降解率可达到94.81%。通过对根癌土壤杆菌SCUEC1菌株进行全基因组序列的BLAST比对分析，推测该菌株的尼古丁降解代谢途径与中间苍白杆菌SYJ1的降解途径相似（梅枫等，2017）。申永防等（2013）从体外分离得到的根癌农杆菌B5，并与嗜烟碱节杆菌的烟碱降解特性进行了对比分析。目前，尚未见关于利用组学数据阐述根癌农杆菌降解烟碱的分子机制的相关报道。基于此，本研究从湖南省永州市烟草生产技术中心多年种植的烟草地中挖掘出高效的根癌农杆菌At_42，并利用组学方法阐释其降解烟草尼古丁的分子机制。研究旨在为尼古丁降解的新型混合途径的分子机制提供新的见解，并为微生物资源的开发与应用提供技术指导。

1.   材料与方法

1.1   菌株At_42全基因组测序与组装

将At_42单菌落接种到LB培养基中，培养至指数生长期。然后在4℃、10 000 g条件下对菌液进行离心，收集1 g菌体并送至华大基因进行全基因组测序。采用de novo测序技术确定细菌全基因组。首先，将提取的基因组DNA随机打断，电泳回收DNA片段后加上接头进行文库制备。随后进行测序，使用Oxford Nanopore Technologies公司的建库试剂盒进行测序文库构建，利用Canu（Ver 1.5）对基因组进行组装。最后，对通用功能进行注释，包括GO、KEGG和COG。

1.2   平均核苷酸一致性(ANI)分析

根据16S rRNA基因序列比对结果，从NCBI网站的Assembly数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/）下载单菌落进化分支所在属的不同种参考菌株的全基因组，选取的11株菌株基因组的登录号分别为：Agrobacterium larrymoorei（GCA_005144425.2），Agrobacterium cavarae（GCA_004310285.1），Agrobacterium vaccinii（GCA_021310995.1），Agrobacterium bohemicu（GCA_001562555.1），Agrobacterium albertimagni（GCA_000300855.1），Agrobacterium salinitolerans（GCA_027498475.1），Agrobacterium deltaense（GCA_900013505.1），A. tumefaciens（GCA_013318015.2），Agrobacterium rubi（GCA_000739935.1），Agrobacterium fabacearum（GCA_900014385.1），和Agrobacterium genomosp（GCA_900012615.1）。采用OAT软件（Ver 0.90）计算各菌株与菌株At_42之间的ANI值进行比对分析。在比较基因组学分析中，ANI值和dDDH值可以评估基因组之间的相似性。一般认为，物种划分的dDDH阈值为70%，或ANI阈值为95%，高于该阈值的菌株则视为同一物种。使用Ezbiocloud（https://www.ezbiocloud.net/tools/ani）和GGDC 3.0（http://ggdc.dsmz.de/）进行分析。

1.3   比较基因组学分析

从NCBI下载A. tumefaciens种属菌株的全基因组序列，随机挑选了A. tumefaciens o5/495，A. tumefaciens 12D1、A. tumefaciens Teh002、A. tumefaciens Teh001、A. tumefaciens Tul001、A. tumefaciens Sj00、A. tumefaciens Sta002、A. tumefaciens Gle001、A. tumefaciens CFBP6623、A. tumefaciens A74a、A. tumefaciens 1D1609和A. tumefaciens G3/79的12个菌株。将12株菌株基本信息汇总（表 3）。通过NCBI的Genome数据库比对分析各个菌株的染色体构成，并进行ANI比对，下载这12株菌的染色体1序列，具体为CP124967.1、CP033031.1、CP048497.1、CP048502.1、CP048493.1、CP048543.1、CP048532.1、CP048569.1、CP039903.1、CP116692.1、CP026924.1和CP115841.1。使用BGRI软件（Ver 0.95）将菌株At_42的染色体1与下载的12株菌的染色体1基因组进行比对分析。

1.4   泛基因组特征分析

使用Prokka软件（Ver 1.2.0）对12株菌株及菌株At_42的基因组进行注释。将获得的注释文件通过Roary进行核心基因组和泛基因组分析。接着，使用在线软件PanGP（http://pangpzha-opage.com/）对结果文件进行泛基因组数据拟合，并利用ggplot2进行可视化。

1.5   菌株At_42烟碱代谢通路基因簇的预测

通过KEGG注释，搜寻At_42全基因组中降解烟碱的基因，并下载A. tumefaciens S33的全基因组序列。使用Easyfig（Ver 2.2.5）对At_42与A. tumefaciens S33的烟碱降解基因簇进行比对。

1.6   烟碱分子对接

采用在线软件AlphaFold Protein Structure Database对菌株At_42的Hsh、NdhA和NdhB基因的氨基酸序列进行结构预测。使用AutoDockTools（Ver 4.2.6）将NdhA和NdhB蛋白质结构与小分子Nicotine进行对接预测，并将Hsh蛋白质结构与6-Hydroxy-3-succinoylpyridine小分子进行对接预测，最后利用PyMOL（Ver 3.1.5.1）处理图片。

1.7   烟碱代谢基因RT-qPCR分析

配置两种培养基，分别向每种培养基中接种2.0%接种量的种子液。烟碱浓度为2 g/L的烟碱培养基作为处理组（CL），葡萄糖铵培养基作为对照组（CK）。在24 h和48 h后，分别在对照组和处理组中取样，每次取2 mL，进行10 000 g，离心1 min。将菌体置于液氮中速冻后，存放于-80℃的冰箱中。采用Primer Premier（Ver 6.0）设计引物，利用Trizol（Vazyme，China）法提取样品的总RNA。采用Color Reverse Transcription Kit（EZB，U.S.A.）进行cDNA的反转录。RT-qPCR采用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（EZB，U.S.A.），配制体系为0.4 μL Primer1，0.4 μL Primer2，0.5 μL cDNA，8.7 μL ddH₂O，10 μL 2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（EZB，U.S.A.），选择At_42的16S rRNA作为内参基因。总RNA的提取、cDNA的合成、定量程序的设计以及2^-△△Ct计算均参照方法（Livak et al.，2001；Yu et al.，2016）。每个试验设置3个重复，不同时间的3个培养基作为3个生物学重复。

1.8   At_42的MS/MS分析

将At_42种子液以1.0%的接种量接种到烟碱浓度为2 g/L的烟碱培养基中，同时设置不接种任何细菌的烟碱浓度为2 g/L的培养基作为对照组。在12 h、24 h、36 h和48 h后，提取CK组与处理组的发酵液，并用0.22 μm滤膜进行过滤。使用液相色谱-电喷雾离子化-四级杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF/MS，Agilent，U.S.A.）检测烟碱代谢产物。液相检测条件为：流速为1 mL/min，柱温为35℃，采用BEH-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），波长259 nm，流动相为甲醇（色谱纯）与水（10∶90 v/v）。质谱条件为：使用正离子源，锥孔电压设定为3 kV，碰撞能量为3 kV，进样量设定为20 μL，离子源温度设定为120℃，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气体选用氮气，氮气流量设定为600 L/h。

1.9   数据统计与分析

利用软件GraphPad Prism（Ver 8.0）进行作图，并使用IBM SPSS Statistics（Ver 25.0）分析实验数据。针对烟碱代谢基因NdhB、NdhA、Hno、Ald、Iso、Nfo、Hpo、Ami、Pno和Hsh的诱导表达模式，采用Two-way ANOVA进行多重分析，评估烟碱处理下这些基因的差异显著性水平。不同星号表示烟碱培养基在不同时间点对烟碱代谢基因表达量的影响（*、**、***和****分别表示P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001；而“ns”表示无显著差异）。

2.   结果与分析

2.1   菌株At_42的基因组序列组装及基本信息

菌株At_42组装结果包括1条环状染色体、1条线性染色体以及2个质粒（详见网络版增强出版材料附图 1）。At_42基因组的大小为5 864 515 bp，平均GC含量为59.24%。该基因组包含5 770个预测的CDS，总长度为5 091 981 bp（表 1）。At_42的环状染色体序列全长为2 959 894 bp，其中G+C含量为59.47%；线性染色体序列全长为2 163 909 bp，其中G+C含量为59.51%。2个质粒的全长分别为660 290 bp和80 422 bp，其中G+C含量分别为57.52%和57.62%。660 290 bp为质粒1，80 422 bp为质粒2。At_42的基因组序列已提交至NCBI的GenBank数据库，基因组登录号为GenBank：CP180431-CP180434。

图  1  菌株At_42与亲缘关系较近11株菌株之间的ANI值

Fig.  1  ANI values between strain At_42 and other closely bacteria

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2.2   基于ANI比对的物种鉴定

通过ANI比对分析，At_42与A. tumefaciens（GCA_013318015.2）之间的ANI值为97.58%，超过95%，因此被判定为同一物种。相对而言，At_42与其余10株菌株的ANI值均低于90%。这表明，菌株At_42与A. tumefaciens（GCA_013318015.2）之间存在较高的亲缘关系（图 1）。根据ANI的结果，菌株At_42被确定为A. tumefaciens At_42（即根癌农杆菌At_42）。

2.3   At_42菌株基因功能注释

At_42菌株在COG数据库中共注释了5 054个基因，其中Cellular占据1 078个基因，Information占据845个基因，Metabolism占据2 435个基因，Poorly占据696个基因。At_42在Metabolism上的基因功能分布占比高，表明其在代谢方面具有较大的潜力（图 2）。At_42在GO数据库中注释了10 739个基因，其中Biological_process占据5 540个基因，Cellular component占据1 344个基因，Molecular function占据3 855个基因（图 3）。在GO基因库的注释中，At_42基因在Biological_process中的占比较高。其中在在Cellular process和Metabolic process的比例也较高，分别注释了1 856个和1 666个基因。At_42在KEGG数据库中注释了4 157个基因，这些基因分为6大类：Cellular Processes占据412个基因、Environmental占据572个基因、Genetic占据200个基因、Human Diseases占据205个基因、Metabolism占据2 684个基因、Organismal Systems占据84个基因。在KEGG数据库中，At_42的基因功能分布较为相似，Metabolism的占比相对较高（图 3）。

图  2  菌株At_42全基因组的COG功能分类

Fig.  2  Gene annotation and functional classification in COG database of strain At_42

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图  3  菌株At_42全基因组的GO（A）和KEGG（B）功能分类

Fig.  3  Gene distribution based on GO (A) and KEGG (B) metabolic pathways of strain At_42

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2.4   农杆菌At_42菌株的基因组差异分析

菌株At_42的染色体有两条：1条为环状，另1条为线性染色体。At_42基因组的大小为5 864 515 bp，平均G+C含量为59.24%（表 3）。菌株At_42的染色体1为环状，其长度为2 908 638 bp，G+C含量为59.47%（详见网络版增强出版材料附图 2）。将从NCBI数据库下载的12株A. tumefaciens的染色体1与菌株At_42的染色体1进行比较（详见网络版增强出版材料附图 2，表 3）。增强出版材料附录Ⅱ所示，这12株农杆菌的染色体1与菌株At_42的染色体1在大部分区域具有较高相似度，显示出较强的同源性。At_42与其他12株菌株在5处存在差异，具体位于染色体1序列的100、1 200、1 700、2 100和2 300 kbp处。100 kbp和1 200 kbp处的差异主要涉及编码假定蛋白（Hypothetic protein）；1 700 kbp处编码一些水解酶、转运蛋白和假定蛋白。2 100 kbp处主要编码转运蛋白、结合蛋白、水解酶和假定蛋白。2 300 kbp处主要编码调控因子、转运蛋白和假定蛋白。其中，在染色体1的1 200 kbp处与其他菌株存在较大差异，该区域主要编码假定蛋白的基因。

2.5   菌株At_42的泛基因组特征分析

通过PGAweb对13株根癌农杆菌A. tumefaciens（At_42，1D1609，12D1，O54/95，A74a，CFBP6623，G3/79，Gle001，SJ001，Sta002，Teh001，Teh002，Tul001）的全基因组进行聚类，共获得29 304个基因和6 550个基因家族。结合全基因组基因聚类结果，利用PanGP软件预测了A. tumefaciens的核心基因组（Core genome）和泛基因组（Pan genome）随基因组数量变化而产生的变化。如图 4所示，泛基因组大小（T）与基因组数（x）的拟合方程为：T =2 892x^0.6844+2 294 (R²= 0.99444565)。该拟合方程表明，泛基因组的大小随基因组数量的增加而增大，说明A. tumefaciens的泛基因组是开放性的。核心基因数目（D）与基因组数（x）的拟合方程为：D=6159.97e^－0.54x + 1300.65 (R² =0.9549069932120513)。由此可知，A. tumefaciens的核心基因数大约为1 301个。

图  4  根癌农杆菌的泛基因组特征曲线

Fig.  4  Pan-genome characteristic curves of Agrobacterium tumefaciens

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2.6   菌株At_42烟碱代谢基因簇分析

KEGG注释显示，At_42与吡咯通路中的尼古丁代谢基因具有高度同源性。分析表明，菌株At_42参与烟碱降解代谢的基因簇位于质粒2上，其相关基因的排列方式如图 5所示。以已报道的根癌农杆菌S33的烟碱代谢相关基因为参考进行序列比对分析，结果发现该基因簇与根癌农杆菌S33的基因簇在基因排列方式及基因编码的蛋白质序列上均具有较高的相似性。共线性分析结果显示，At_42的烟碱代谢基因簇与根癌农杆菌S33的相似度为66%，且At_42中存在与根癌农杆菌S33中NdhB、NdhA、Pno、Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo、Hno高度相似的基因，NdhB、NdhA、Pno、Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo、Hno被报道是根癌农杆菌S33参与烟碱降解的关键基因。KEGG注释At_42烟碱代谢基因的相似度如表 4所示。其中与马来酸顺反异构酶（Iso）的相似性为97.2%，与2, 5-二羟基吡啶双加氧酶（Hpo）的相似性为94.7%，与尼古丁脱氢酶亚基A（NdhA）的相似性为91.6%，这3种基因的相似性最为显著（图 5，表 4）。

图  5  菌株At_42的基因簇与根癌农杆菌S33的基因簇比较

注：图右下角百分值表示基因核苷酸序列相似度。

Fig.  5  Comparison of gene clusters between strain At_42 and Agrobacterium tumefaciens S33

Note: Percentage value in the lower right corner of the figure represented the similarity of gene nucleotide sequences.

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2.7   At_42与尼古丁的分子对接

分子模拟结果显示，尼古丁（Nicotine）与At_42中的NdhA（图 6-B）和NdhB（图 6-A）结合。尼古丁能够与At_42的NdhB蛋白结构中的ASN-129结合，形成1个氢键，总结合能为-5.28 kcal/mol。此外，尼古丁也可以与At_42的NdhA蛋白结构中的ALA-280结合，同样形成1个氢键，结合能为-5.27 kcal/mol。6-Hydroxy-3-succinoylpyridine能够与At_42的Hsh蛋白结构结合（图 6-C），6-Hydroxy-3-succinoylpyridine能够分别与Hsh蛋白结构的ARG-247、GAT_4267、ARG-247和SER-239结合，共同形成4个氢键，结合能为-5.47 kcal/mol。

图  6  At_42菌株烟碱降解酶与烟碱以及烟碱代谢产物的分子对接

注：A，分子对接预测NdhB与烟碱的结合；B，分子对接预测NdhA与烟碱的结合；C，分子对接预测Hsh与6-Hydroxy-3-succinoylpyridine的结合。

Fig.  6  Illustrates the molecular docking of nicotine-degrading enzymes with nicotine and its metabolites in strain At_42

Note: A, Presented the molecular docking prediction of NdhB binding to nicotine; B, Showed the molecular docking prediction of NdhA binding to nicotine; C, Displayed the molecular docking prediction of Hsh binding to 6-hydroxy-3-succinoylpyridine.

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2.8   菌株At_42烟碱代谢基因簇的RT-qPCR检测

通过对烟碱代谢基因簇的9个关键基因（NdhB、NdhA、Pno、Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo、Hno）进行RT-qPCR检测（图 7）。Two-way ANOVA多重分析显示，菌株At_42在烟碱培养基中培养24 h后，与对照组CK相比，NdhB、NdhA、Pno和Hno基因的表达量显著升高，且与对照组相比达到了极显著差异水平（P < 0.01）。而Hsh和Hpo基因的表达被抑制。Ami、Nfo和Iso基因的表达未显示显著变化；在烟碱培养基中，菌株At_42在48 h时，Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo和Hno基因的表达量显著升高，与CK组相比，菌株At_42的烟碱相关基因达到了显著差异水平（P < 0.05）。然而，NdhA、NdhB和Pno基因在48 h的表达量与对照组相比无显著差异。本研究表明，菌株At_42在烟碱培养基中培养后，烟碱相关基因的表达模式不一致，这9个基因在不同时间点均被显著诱导。

图  7  RT-qPCR检测At_42中烟碱代谢基因mRNA表达水平

注：At_42基因组中，烟碱代谢基因NdhB、NdhA、Pno、Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo、和Hno的诱导表达模式进行了分析。图中数值为平均值±标准误（n=3）。不同星号表示烟碱培养基对不同时间点烟碱代谢基因表达量的差异（*、**、***和****分别表示P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001；ns表示没有显著差异。数据通过Two-way ANOVA多重分析进行评价）。

Fig.  7  mRNA expression level of nicotine metabolism gene in At_42 was detected by RT-qPCR

Note: This study analyzes the induced expression patterns of nicotine metabolism genes NdhB, NdhA, Pno, Nfo, Hsh, Iso, Ami, Hpo and Hno within the At_42 genome. The values presented in the figure represent the mean ± standard error (n = 3), with different asterisks indicating variations in the expression levels of these genes in response to nicotine culture at various time points. We employed Two-way ANOVA for multiple comparisons to evaluate the data. The symbols *, **, ***, and **** denote significant differences at P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, and P < 0.0001, respectively, while ns indicated non-significant differences.

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2.9   At_42代谢烟碱产物MS/MS检测

利用MS/MS对At_42代谢的烟碱产物进行检测，网络版增强出版材料附图 3所示。2, 5-二羟基吡啶（2, 5-Dihydroxypyridine）的结构裂解离子碎片与MS/MS检测到的网络版增强出版材料附图 3-A离子峰高度吻合，主峰为112.8393 m/z，离子碎片峰为94.0290 m/z和76.0184 m/z。6-羟基假氧尼古丁（6-Hydroxypseudooxy nicotine）的结构裂解离子碎片与MS/MS检测到的网络版增强出版材料附图 3-B离子峰高度吻合，主峰为177.1022 m/z，碎片离子峰为84.0810 m/z、103.0543 m/z、120.0809 m/z、130.0651 m/z、148.0756 m/z和161.0710 m/z。6-羟基-N-甲基肌胺（6-Hydroxy-N-methylmyosmine）的结构裂解离子碎片与MS/MS检测到的网络版增强出版材料附图 3-C的离子峰高度吻合，主峰为195.1124 m/z，碎片离子峰分别为66.0343 m/z、94.0284 m/z、122.0236 m/z、148.0748 m/z和164.0705 m/z。马来酸盐的结构裂解离子碎片与MS/MS检测到的网络版增强出版材料附图 3-D的离子峰高度吻合，主峰为118.0861 m/z，离子峰分别为58.0655 m/z、71.0130 m/z和99.0077 m/z。在烟碱的代谢过程中，At_42可能会产生6-羟基-N-甲基肌胺（6-Hydroxy-N-methylmyosmine）、6-羟基假氧尼古丁（6-Hydroxypseudooxynicotine）、2, 5-二羟基吡啶（2, 5-Dihydroxypyridine）和马来酸盐（Maleamate）。6-羟基-N-甲基肌胺和6-羟基假氧尼古丁是烟碱代谢中吡啶途径的产物，而2, 5-二羟基吡啶和马来酸盐是烟碱代谢中吡咯途径的产物。

3.   结论与讨论

近年来，随着全基因组测序技术的飞速发展，越来越多的物种被测序，从而为比较基因组学研究奠定了基础（Caputo et al.，2019）。全基因组测序技术能够通过微生物基因组水平的平均核苷酸一致性分析（ANI）快速准确地对微生物进行分类。通过该技术，可以更深入地研究微生物合成途径的遗传调控机制和代谢途径，挖掘新型生物活性物质的合成途径，为抗生素、酶类和化学品等的生产与开发提供新的思路和方法（Tettelin et al.，2005；Zhu et al.，2016）。同时，大量细菌基因组数据为深入了解物种内部多样性提供了丰富的资源。这些数据有助于揭示相似生物类群的环境适应性分子遗传共性及其演化规律（赵凡冲等，2023）。利用生物信息学工具对物种基因组的比较分析发现，基因组中既包含非常保守的区域，也存在非保守区域（赵贵军等，2002）。这些非保守区域常与物种的多样性相关，因此，单一基因组无法完全代表物种。同时，这些基因组还需与其他已公布菌株的数据进行比较，以构建系统发育树，为新菌株环境适应性的遗传基础与功能多样性的演化机制提供新的线索。本文通过生物信息学技术挖掘鉴定烟碱降解菌并探究其降解功能和代谢途径，为保护环境避免尼古丁污染以及探究微生物功能多样性提供更多数据基础。

根癌农杆菌广泛分布于土壤中，属于革兰氏阴性菌，隶属于变形菌门Proteobacteria和根瘤菌科Rhizobiaceae。研究发现，放射性农杆菌Agrobacterium radiobacter LN-1的基因组大小为5.5 Mbp，G+C含量为59.4%。由1条环状染色体和1条线性染色体组成。其中，菌株LN-1的环状染色体长度为2.91 Mbp，G+C含量为59.6%（赵凡冲等，2023）。且A. tumefaciens S33的基因组由5.48 Mbp的碱基组成，分为2条染色体：1条环状染色体，长度为2.49 Mbp，G+C含量为59.0%；另1条线性染色体，长度为2.98 Mbp，G+C含量为59.3%（Yu et al.，2016）。本文中At_42的基因组长度为5.86 Mbp，G+C含量为59.24%，包含5 770个预测的CDS。分析该菌株的基因组后发现，At_42同样由1条环状染色体和1条线性染色体组成。此外，该菌株还携带2个质粒（详见网络版增强出版材料附图 1）。这些结果与之前的研究相似。通过CDS序列的翻译，在GO、COG、KEGG数据库中分别注释了10 739、5 054和4 157个蛋白的功能，三个数据库的注释结果具有较高一致性（图 2）。在全基因组ANI比对中，菌株At_42与A. tumefaciens（GCA_013318015.2）聚类非常接近，ANI值达到99.56%，说明两者之间存在较高的亲缘关系（图 1），菌株At_42被确定为A. tumefaciens At_42（即根癌农杆菌At_42）。通过比较基因组学，本文对菌株At_42的染色体1与从NCBI数据库下载的12株农杆菌的染色体1进行了比较（详见网络版增强出版材料附图 2，表 3）。菌株At_42的染色体1与这12株农杆菌的染色体1在大部分区域的相似度较高，显示了较强的同源性。At_42与其他12株菌株存在5处差异。其中，在染色体环1的1 200 kbp处，At_42与其他菌株存在较大差异，该区域主要编码假定蛋白（Hypothetical protein）的基因，其功能尚不明确（详见网络版增强出版材料附图 2）。本研究结果与放射性农杆菌A. radiobacter的结果类似。

泛基因组（Pan-genome）是指在整个物种或种群中所有个体的基因组序列合集，包含了遗传信息，反映基因组之间的结构变异和多样性。它涵盖核心基因组（Core genome）、可变基因组（Accessory genome）以及私有基因（Private genes）或个体特异基因（Strain-specific genes）（Medini et al.，2005；Brynildsrud et al.，2016；关海霞，2021）。泛基因组分析任何特定物种均可获得准确的基因库信息，这为后续分析细菌的基因功能、环境适应性及致病机制提供了思路（Brynildsrud et al.，2016；Caputo et al.，2019）。物种的泛基因组可分为开放型（Open pan-genome）和封闭型（Close pan-genome），这与物种所处的生态位有关（Medini et al.，2005）。对于封闭型泛基因组，新菌株基因组测序完成后产生新基因的可能性较小。相反，在开放型泛基因组中，每当增加一株新菌株时，通常会有新的基因加入物种的基因库中，从而使泛基因组不断增大。Medini对8株链球菌（Streptococcus agalactiae）的基因组进行了比较分析，结果显示泛基因组大小为2 713，其中1 806个基因为核心基因，907个基因属于附属基因。可以预测，该物种每新增1个基因组序列，平均将增加33个新基因，表明链球菌拥有一个开放的泛基因组（Medini et al.，2005）。赵凡冲等人对6株根癌农杆菌的泛基因组进行了分析，发现根癌农杆菌的泛基因组属于开放型。这表明，环境中的根癌农杆菌可以与其他物种进行遗传物质交换，从而获得新基因（赵凡冲等，2023）。本研究得到的泛基因组大小（T）与基因组数（x）的拟合方程为：T = 2892x^0.6844 + 2294 (R²= 0.99444565)。该结果表明，泛基因组的大小随着基因组数量的增加而增加（图 4）。这进一步证明了根癌农杆菌的泛基因组具有开放型特征。本研究结果与链球菌家族及根癌农杆菌的结果一致。这为进一步研究不同来源根癌农杆菌的环境适应性提供了分子基础，并为烟碱降解研究提供了基础材料。

目前，微生物在调控烟草废弃物中的烟碱方面发挥着积极作用，并具有重要的应用前景。烟碱降解菌大多数是好氧微生物，主要通过矿化方式对烟碱进行降解。这些菌株具有较强的耐烟碱性，能够将烟碱转化为无毒物质，从而有效降解有毒有害废弃物（Sandu et al.，2003；Ruan et al.，2006；Tang et al.，2011；Wang et al.，2012；Yao et al.，2015；Li et al.，2017）。微生物降解尼古丁的途径主要有4种：（1）吡啶降解途径，其代谢产物主要包括6-羟基尼古丁和6-羟基-N-甲基麦斯明等，代表属为节杆菌属Arthrobacter（Ruan et al.，2006；Yao et al.，2015）。（2）吡咯降解途径，其代谢产物主要主要包括2, 5-二羟基吡啶、假氧化尼古丁和3-琥珀酰吡啶等，代表属为假单胞菌属Pseudomonas（Duan et al.，2013）。（3）去甲基途径以真菌米曲霉Aspergillus oryzae为代表，其代谢产物主要包括去甲基尼古丁、麦斯明、N-甲基烟酰胺和2, 3-联吡啶等。（4）吡啶和吡咯混合途径（Variant of the pyridine and pyrrolidine，VPP）以根癌农杆菌Agrobacterium（Li et al.，2016）、苍白杆菌Ochrobactrum（Yu et al.，2015）和鞘氨醇单胞菌Sphingomonas为代表（Wang et al.，2023）。其代谢产物包括6-羟基尼古丁、6-羟基-N-甲基麦斯明和2, 5-二羟基吡啶。最近研究报道，根癌农杆菌菌株S33对尼古丁降解属于VPP途径，它结合了吡啶和吡咯烷途径的元素（Li et al.，2016）。这种混合途径与Shinella sp. HZN7菌株（Qiu et al.，2016）和Ochrobactrum sp. SJY1菌株（Yu et al.，2015）中鉴定的结果相似。农杆菌菌株S33降解尼古丁的代谢途径首先通过吡啶途径转化为6-羟基尼古丁，然后通过6-羟基-N-甲基肌胺转化为6-羟基假氧尼古丁。接着，6-羟基假氧尼古丁通过6-羟基-3-琥珀酰-半醛-吡啶转化为6-羟基-3-琥珀酰吡啶（HSP）。此后，混合途径通过HSP和2, 5-二羟基吡啶，最终进入三羧酸（TCA）循环（Huang et al.，2021；Huang et al.，2017）。孔雯利用GC-MS初步分析了根癌农杆菌BKCER11菌株降解烟碱的中间代谢产物，检测到3-（2, 3, 4-三氢-5-吡咯基）-吡啶和可替宁两种新物质的积累。这与已知的微生物代谢烟碱的3种途径中所涉及的物质均不相同（孔雯，2011）。张豪洋利用高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS），在根癌农杆菌LN-1降解烟碱的发酵液中共检测到三种中间代谢产物，分别是6-羟基-3-琥珀酰吡啶（6-Hydroxy-3-Succinoyl-Pyridine，HSP）、6-羟基烟碱（6-Hydroxynicotine，6HN）和3-琥珀酰吡啶（3-Succinoyl-Pyridine，SP）（张豪洋，2021）。在本研究中，利用MS/MS检测了At_42降解烟碱的代谢物，发现了6-羟基-N-甲基肌胺、2, 5-二羟基吡啶、6-羟基假氧尼古丁和马来酸盐。其中，6-羟基-N-甲基肌胺和6-羟基假氧尼古丁是通过吡啶途径生成的产物，而2, 5-二羟基吡啶和马来酸盐则是通过吡咯途径生成的。根据检测结果，本研究推测根癌农杆菌At_42也属于VPP代谢途径降解烟碱。然而，本研究检测到的代谢物与其他研究报道的根癌农杆菌的代谢物并不一致，但是这些产物与VPP代谢路径相吻合。

根癌农杆菌的研究目前相对较少，尤其是对催化尼古丁降解的基因。目前在根癌农杆菌A. tumefaciens S33报道了部分的尼古丁降解基因，Huang等（2017）分析了根癌农杆菌菌株S33在葡萄糖铵培养基和尼古丁培养基下的转录组和基因组。研究表明，菌株S33中的9个尼古丁降解基因（Hsh、Pno、Ami、Hpo、Nfo、Iso、Hno和NdhAB）在尼古丁培养基中的转录活性显著高于葡萄糖铵培养基，RT-qPCR分析证实了这9个基因（NdhA、NdhB、Hno、Pno和Hsh）的表达水平（Yu et al.，2016；Huang et al.，2017）。研究进一步说明了这些基因在菌株S33的尼古丁分解代谢中发挥关键作用，并且它们的转录活性依赖于尼古丁的存在。本研究通过基因组分析发现，菌株At_42参与烟碱降解代谢的基因簇定位于质粒1上。对菌株At_42与根癌农杆菌S33的烟碱代谢相关基因进行了共线性分析，结果显示二者之间的共线性关系良好，At_42的烟碱代谢基因簇与根癌农杆菌S33的相似度为66%（图 5，表 4）。然而，基因组分析发现菌株LN-1参与烟碱降解代谢的基因簇定位于染色体2上（赵凡冲等，2023），这一结果与前述研究结果不一致。进一步的分子对接结果显示，At_42能够与尼古丁结合（图 6）。针对At_42菌株中尼古丁降解基因簇内9个直接催化尼古丁降解的基因（NdhA、NdhB、Pno、Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo、Hno）进行了RT-qPCR检测（图 7）。采用Two-way ANOVA进行多重分析，At_42菌株在尼古丁培养基中培养24 h后，与对照组CK相比，环状染色体上的尼古丁降解基因簇NdhA、NdhB、Pno和Hno的表达水平显著上调（P < 0.01）。在培养48 h后，与对照组CK相比，Nfo、Hsh、Iso、Ami、Hpo和Hno基因的表达水平显著升高（P < 0.05）（图 7）。由此可推测，这些基因也参与了At_42菌株的尼古丁降解过程。然而，菌株At_42中尼古丁基因的表达具有时序性，其中Hpo和Hno基因始终维持高表达。这表明本研究结果与此前研究大致相符。

本研究基于实验室早期分离获得的一株能够高效降解尼古丁的根癌农杆菌At_42，利用基因组学和生物信息学详细分析了其烟碱代谢基因，通过RT-qPCR进行了进一步验证，最后利用MS/MS确认癌农杆菌At_42菌株的代谢途径为VPP代谢途径。然而，目前针对根癌农杆菌At_42降解烟碱的代谢途径和分子机制仍需深入研究，以期发现新的烟碱代谢途径和功能基因。

附录：附图 1根癌农杆菌At_42的2个染色体（A，B）和2个质粒（C，D）的环状表示

附图 2菌株At_42的染色体1与12株农杆菌菌株的染色体1的比较

附图 3质谱法分析At_42对尼古丁降解的代谢产物

详细数据见网络版增强出版材料（http://hjkcxb.alljournals.net/）

附图 1  根癌农杆菌At_42的2个染色体(A, B)和2个质粒（C, D）的环状表示

注：A，根癌农杆菌At_42的环状染色体；B，根癌农杆菌At_42的线染色体；C和D，根癌农杆菌At_42的质粒。外面的2个环分别表示编码在染色体正向链和反向链上的基因，使用COG数据库进行分析（根据COG功能类别的颜色代码分配颜色）。第3个圆圈表示预测的GI（红色）、原噬菌体（绿色）和尼古丁降解基因（紫色）。在第4个环上，绘制了与平均G+C含量的偏差。最内环显示GC偏差(G-C/G+C)的值。

Appendix Fig. 1  Circular representation of the two chromosomes (A, B) and two plasmids (C, D) of Agrobacterium tumefaciens At_42

Note: A, circular chromosome of A. tumefaciens At_42; B, linear chromosome of A. tumefaciens At_42; C and D, plasmids of A. tumefaciens At_42. The two outer rings represent genes encoded on the forward and reverse chains of chromosomes, respectively, and are analyzed using the COG database (assigned colors according to color codes for COG functional categories). The third circle represents the predicted GI (red), prophage (green), and nicotine-degrading genes (purple). On the fourth ring, the deviation from the average G+C content is plotted. The innermost ring displays the value of the GC deviation (G-C/G+C).

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附图 2  菌株At_42的染色体1与12株农杆菌菌株的染色体1的比较

注：从最内圈到最外圈，第1圈表示菌株At_42的染色体1的大小；第2圈和第3圈分别表示(G+C)含量和GC偏斜；第4到第15圈分别表示12株农杆菌菌株的染色体1，以菌株At_42的染色体1为参考，其顺序与表 3中的顺序一致；最外圈则为菌株At_42的染色体1；1~5表示菌株At_42染色体1特有的区域。

Appendix Fig. 2  Comparison of chromosome 1 between strain At_42 and 12 strains of Agrobacterium

Note: From the innermost ring to the outermost ring, the first ring represents the size of chromosome 1 of strain At_42. The second and third rings illustrate the (G+C) content and GC skew, respectively. The fourth to the fifteenth rings depict chromosome 1 of twelve strains of Agrobacterium, using chromosome 1 of strain At_42 as the reference. The arrangement of these rings corresponds with the order specified in Table 3. The outermost ring represents chromosome 1 of strain At_42, while regions 1 to 5 indicate specific areas of chromosome 1 of strain At_42.

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附图 3  质谱法分析At_42对尼古丁降解的代谢产物

注：图A, B, C, D: At_42处理后在尼古丁溶液中检测到的代谢物，6-羟基-N-甲基肌胺、6-羟基假氧尼古丁、2, 5-二羟基吡啶和马来酸盐的MS/MS峰图。

Appendix Fig. 3  MS/MS analysis of the nicotine degradation metabolites in strain At_42

Note: A, B, C, D: At_42 treatment of metabolites detected in nicotine solutions, MS/MS peak graph for 6-Hydroxy-N-methylmyosmine, 6-Hydroxypseudooxynicotine, 2, 5-Dihydroxypyridine, Maleamate.

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