由于人类活动造成二氧化碳等温室气体大量排放，导致地球表面和下层大气的温度升高，从而引发全球气温的持续上升，给自然界带来了巨大的影响和挑战（陈睿山等，2021）。昆虫作为变温动物，自身体温调节能力较弱，环境温度的升高可能会影响它们的生长发育、存活、繁殖等行为，并进一步导致其种群动态和地理分布的改变（Sutherst et al.，2011；白月亮等，2022）。这些变化往往伴随着昆虫生理生化的变化，包括蛋白质变形失活、含水量降低、新陈代谢加快、神经和内分泌系统紊乱等（杜尧等，2007；Lehmann et al.，2020）。在全球气候变暖的趋势下，昆虫耐高温能力直接影响着自身适合度。同时，昆虫在数百万年的进化过程中形成了通过生理行为、体内大/小分子物质调节等方式减少高温胁迫损伤的适应能力（王艳敏等，2010）。例如，中华稻蝗Oxya chinensis的Hsp19.8/Hsp20.4基因和赤拟谷盗Tribolium castaneum的Hsp27基因在40℃高温处理后表达量迅速上调，表明热激蛋白（Heat shock protein，HSP）在昆虫应对热应激中发挥关键作用（García-Reina et al.，2017；Zhao et al.，2021）。此外，意大利蝗Calliptamus italicus在高温条件下通过积累海藻糖、游离蛋白质和不饱和脂肪酸等抗逆保护物质来增强耐热性，且雌性个体的高温耐受能力显著高于雄性个体（Carly et al.，2012；李爽等，2015）。家蚕Bombyx mori的研究进一步表明，外源添加γ-氨基丁酸可通过调控糖脂代谢相关基因的表达，有效缓解高温胁迫对其生理功能的影响（徐静婕和屠洁，2024）。而筛豆龟蝽Megacopta cribraria成虫和短翅蚜小蜂Aphelinus asychis在高温胁迫下，其体内的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性均显著升高，表明抗氧化系统在昆虫应对高温胁迫中具有重要作用（崔娟等，2021；Xiang et al.，2022）。

天敌昆虫作为农业生态系统中的第三营养级，对农业害虫具有重要的控制作用（余文远和张世泽，2022）。在自然界，与害虫种群发生相比，天敌昆虫种群的发生具有明显的滞后效应，对温度等环境因子的变化也更加敏感（Voigt et al.，2003）。全球气候变暖可能引起害虫和天敌之间的同步性失调，进而导致害虫生物防治效果的降低。研究气候变化对天敌的影响具有重要意义，通过深入研究高温胁迫对天敌的影响，有利于更好地阐明天敌在高温环境下的适应能力，进而揭示其应对高温胁迫的生理、行为和分子机制，为改善天敌在生物防治过程中的应用提供科学依据（Thomson et al.，2010）。

蠋蝽Arma chinensis，属半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae蠋蝽属Arma（高卓等，2011），是一类杂食性天敌昆虫，捕食能力强、捕食范围广，可捕食鳞翅目Lepidoptera、鞘翅目Coleoptera、膜翅目Hymenoptera以及半翅目Hemiptera等40多种农林害虫的卵、幼虫、成虫以及蛹（Zhen et al.，2022；王桦等，2024），搜寻到害虫后，可将口针刺入害虫的头、胸或腹部，然后刺吸害虫的体液，在害虫生物防治中具有广泛的应用前景（Shapiro and Legaspi，2006；唐艺婷等，2009；任春燕等，2022）。目前，已有研究报道高温胁迫后蠋蝽的生物学特性，但蠋蝽高温胁迫后的分子响应机制未见报道。为进一步了解蠋蝽对高温的适应机制，本研究利用高通量测序技术，分析蠋蝽在不同高温处理时间（0 h、6 h、12 h）后的基因表达变化，探讨高温胁迫相关差异表达基因的功能及相关代谢通路，为研究天敌昆虫的耐热分子机制提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   供试虫源

蠋蝽来源贵州省烟草科学研究院，于人工气候箱内用粘虫饲养，饲养条件为温度（26 ± 1）℃、相对湿度（65 ± 5）%、光周期16 L∶8 D（孟建玉等，2023）。

1.2   高温处理

将蠋蝽成虫从（26 ± 1）℃常规饲养温度条件下转移至38℃高温进行胁迫处理，处理时间分别为0 h（Control）、6 h（HT6h）、12 h（HT12h），处理过程中光照和湿度与正常饲喂条件一致。高温胁迫处理后，立即将样品置于液氮中保存，每个处理取5头，重复3次。

1.3   总RNA提取、cDNA文库构建和Illumina测序

采用invitrogen TRIzol^® Reagent试剂盒提取不同处理下蠋蝽总RNA，利用凝胶电泳检测RNA完整性，NanoDrop 2000检测RNA浓度与纯度，Agilent 2100 bioanalyzer精确检测RNA完整性。使用Oligo（dT）磁珠通过碱基互补方式富集mRNA，加入Fragmentation Buffer将mRNA打成短片段。而后以mRNA为模板，利用随机引物合成cDNA第1链，进行双链cDNA合成。双链cDNA使用AMPure XP beads进行纯化，随后对纯化的双链cDNA进行末端修复，在3'末端加上poly（A）并连接测序接头。采用AMPure XP beads进行片段大小分选，然后通过PCR对片段进行扩增。构建好的文库质检合格后，采用Illumina NovaSeq 6000平台（Illumina，USA）进行测序。

1.4   测序数据质控

对高通量测序获得的原始序列（Raw reads）进行质控分析：包括碱基含量、质量、错误率的分布统计，对数据进行过滤，去除含测序接头（Adapter）的reads、含N的reads及低质量reads（Qphred ≤ 20的碱基数占整个read长度的50%以上的reads）。同时，对Clean data进行Q20、Q30和GC含量计算，从而得到高质量的序列数据（Clean reads）。使用Trinity软件对Clean reads进行拼接以获取后续分析的参考序列。采用BUSCO软件对拼接得到的Trinity.fasta、unigene.fasta和cluster.fasta进行拼接质量的评估。最后基于Nr、Nt、Pfam、PFAM、KOG、Swiss Prot、KEGG、GO对基因功能进行注释。

1.5   差异表达基因筛选与表达分析

使用RSEM软件对基因组的比对结果进行表达定量分析，得到各个样本基因/转录本的read counts，应用FRKM（Fragments per Kilobase per Million Reads）量化标准对其进行表达量计算。基因的差异比对采用DESeq2（1.20.0）软件进行分析，采用Benjamini和Hochberg法对差异检验的P值（padj）进行检验校正以控制错误发现率（False Discovery Rate，FDR），差异基因| log₂（Fold Change）| ≥ 1且P ≤ 0.05（Love et al.，2014）。采用GOseq（1.10.0）和KOBAS（v2.0.12）软件对差异基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6   高温胁迫后蠋蝽转录组测序数据的验证

为验证转录组测序数据的正确性，随机挑选10个差异表达基因，以β-actin为内参基因进行qRT-PCR检验。利用Primer premier 6软件设计引物（表 1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用Eastep^® Super Total RNA Extraction Kit提取蠋蝽总RNA，使用Nano Photometer^TM P-Class分光光度仪检测其浓度，采用StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Kit（Genestar）完成cDNA第1链的合成。按照TB Green^® Premix DimerEraser^TM试剂盒（TaKaRa）进行RT-qPCR，反应体系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物（0.01 mol/ L）各1 μL，cDNA模板1 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，DEPC水6.6 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，40个循环。

2.   结果与分析

2.1   测序数据评估及对比结果

蠋蝽转录组经过原始数据过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查后，共得到59.9 Gb质控数据，9个样品的质控数据均达到6.3 Gb以上，错误率均为3%，Q20碱基百分比在97.18%以上，Q30碱基百分比在92.14%以上，GC含量在36.88%~39.80%之间，表明所测数据准确（表 2）。

为了获得全面的基因功能信息，利用七大数据库（NR、NT、Pfam、KOG、Swiss Prot、KEGG、GO）分别对蠋蝽的unigenes进行功能注释，共得到62 564个unigenes。其中，NR注释的unigenes最多23 444（40.84%），其次是PFAM 16 026条（27.91%）、GO 16 024条（27.91%）、NT 13 936条（24.27%）、SwissProt 13 837条（24.10%）、KO 8 843条（15.40%）、KOG 8 045条（14.01%）。

2.2   差异表达基因分析

对高温处理0 h（Control）、6 h（HT6h）、12 h（HT12h）下蠋蝽转录组进行差异显著性分析。结果显示，比较组HT6h vs Control共有1 613个差异表达基因，其中768个表达上调和845个表达下调；比较组HT12h vs Control共有2 023个差异表达基因，其中789个表达上调和1 234个表达下调；比较组HT12h vs HT6h共有699个差异表达基因，其中320个表达上调和379个表达下调。通过差异表达基因筛选，发现比较组HT6h vs Control、HT12h vs Control、HT12h vs HT6h均有22个基因注释到HSP，1个基因显著上调；37个基因注释到热休克蛋白40家族（DnaJ homolog subfamily，DnaJ），1个基因显著上调；62个基因注释到细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450），4个基因显著上调；33个基因注释到UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT），2个基因显著上调。

图  1  高温胁迫后蠋蝽差异表达基因火山图

Fig.  1  Differentially expressed genes volcano map of Arma chinensis under high temperatures

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2.3   差异表达基因GO富集分析

差异基因经GO富集分析发现（图 2），参与生物过程（Biological processes）的差异表达基因数目较多，参与分子功能（Molecular function）的次之，参与细胞组分（Cellular component）的差异表达基因数目较少。其中HT6h vs Control组中共有1 921个差异基因显著富集到生物学过程、细胞组分和分子功能，共118个功能分类中，其中注释到生物学过程58个、注释到细胞组分27个、注释到分子功能33个。HT12h vs Control组共有2 625个差异基因显著富集到生物学过程、细胞组分和分子功能，共121个功能分类中，其中注释到生物学过程59个、注释到细胞组分27个、注释到分子功能35个。HT12h vs HT6h组共有871个差异基因显著富集到生物学过程、细胞组分和分子功能，共120个功能分类中，其中注释到生物学过程49个、注释到细胞组分19个、注释到分子功能31个。

图  2  高温胁迫后蠋蝽差异表达基因的GO功能分类

Fig.  2  GO functional classification of in the transcriptome of Arma chinensis under high temperatures

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2.4   差异表达基因KEGG富集分析结果

为明确哪些通路在高温的诱导下被显著调控，将差异表达基因映射到KEGG路径库中进行富集分析（图 3）。结果显示，HT6h vs Control组中共有885个差异基因被注释到KEGG中的265条不同通路中，富集的通路主要涉及视黄醇代谢（Retinol metabolism）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、生热作用（Thermogenesis）等代谢通路。对这些通路进行显著性分析发现，共有39个差异基因显著富集到这3条通路中，其中7个差异基因富集到坏死通路、15个差异基因富集到抗原加工和呈递通路、17个差异基因富集到次生代谢物的生物合成通路。

图  3  高温胁迫后蠋蝽差异表达基因KEGG通路富集前20条

Fig.  3  Top 20 scatter plot of KEGG enrichment analysis of Arma chinensis under high temperatures

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HT12h vs Control组中共有907个差异基因被注释到KEGG中的276条不同通路中，富集的通路主要涉及赖氨酸降解（Lysine degradation）、药物代谢酶细胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450）、细胞色素P450对外源物质代谢（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）等代谢通路。对这些通路进行显著性分析发现，共有38个差异基因显著富集到这4条通路中，其中22个差异基因富集到坏死通路、8个差异基因富集到抗原加工和呈递通路、8个差异基因富集到核苷酸结合寡聚域受体样受体信号通路。

HT12h vs HT6h组中共有635个差异基因被注释到KEGG中的261条不同通路中，富集的通路主要有溶酶体（Lysosome）、细胞凋亡（Apoptosis）。对这些通路进行显著性分析发现，共有20个差异基因显著富集到这2条通路中，其中11个差异基因富集到坏死通路、9个差异基因富集到抗原加工和呈递通路。

2.5   qRT-PCR验证

蠋蝽高温胁迫后随机筛选10个差异表达基因进行qRT-PCR验证，结果表明差异表达基因表达结果与转录组测序结果基本一致，表明转录组测序得到的数据可靠（图 4）。

图  4  高温胁迫后蠋蝽10个差异基因的相对表达量

Fig.  4  Relative expression level of 10 genes associated of Arma chinensis under high temperatures

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3.   结论与讨论

本研究通过高通量测序技术对分别置于38℃高温0 h、6 h、12 h后的蠋蝽进行测序与拼装，并进行差异表达分析。测序结果显示，HT6h vs Control有1 613个差异表达基因（768个表达上调和845个表达下调）；HT12h vs Control有2 023个差异表达基因（789个表达上调和1 234个表达下调）；HT12h vs HT6h有699个差异表达基因（其中320个表达上调和379个表达下调）。HT12h vs Control处理后的差异表达基因最多，推测蠋蝽长期受高温诱导后将调动更多基因以抵御热胁迫，故其差异表达基因数量多于HT6h vs Control温度胁迫后的差异表达数量。比较组HT12h vs Control、HT6h vs Control、HT12h vs HT6h的差异表达基因有重合，主要有HSP、DnaJ、CYP450、UGT基因，表明这些基因能够同时响应外界的高温胁迫。

热激蛋白是一类高度保守的蛋白质，在生物体内通常和分子伴侣或辅助蛋白一起协作，通过促进变形蛋白或参与蛋白的合成、折叠、和组装等生命活动来保持昆虫细胞内的环境稳定（King and Macrae，2015）。作为分子伴侣，当生物体受到逆境胁迫后，体内大量合成热激蛋白维持其正常的生理功能，保护其免受损害（崔旭红等，2007）。白背飞虱Sogatella furcifera SfHsp70-1基因在40℃（10 min、30 min、60 min）诱导后转录水平显著提高，较对照（25℃）分别提高138.96%、75.67%和61.10%（许铁龙和周操，2014）。松墨天牛Monochamus alternatus中MaltHSP40-1及MaltHSP40-2在42.5℃处理3 h后，其相对表达量在各组织中的均显著上调（杨华磊等，2024）。随着38℃处理时间的延长，蠋蝽体内AcHsp83a和AcHsp83b的表达量均先上升后下降，在6 h时达到最高（孟建玉等，2023）。相似的，本研究转录组结果中蠋蝽在高温处理后有HSP基因被诱导上调表达，说明HSP在蠋蝽对高温的适应机制中发挥作用。

DnaJ家族通常也被称为Hsp40家族或J蛋白，DnaJ基因家族与Hsp70发挥功能密切相关，多个DnaJ蛋白可作为单个Hsp70的辅助蛋白，是Hsp70功能多样性的主要驱动因素（Kampinga and Craig，2010）。DnaJ蛋白与Hsp70结合可刺激Hsp70中的ATP水解，促进错误蛋白的解离，从而稳定底物结合，在响应高温胁迫中扮演重要作用（Pablo and Dario，2018）。目前DnaJ应对热胁迫的功能研究多集中在植物上，如在耐热香葱Allium ascalonicum AF60中，AfDnaJ的表达量在高温胁迫24 h、48 h、72 h后比0 h分别增加了1.9倍、1.9倍和3.1倍（文俊丽等，2023）；黄瓜Cucumis sativus CsDnaJ基因在高温环境（昼/夜温度为42℃/35℃）下被诱导高表达（宋蒙飞等，2021）。但在昆虫中未见相关报道。本研究结果显示，蠋蝽在38℃处理后有基因注释到DnaJ中，并有1个DnaJ基因显著上调，说明蠋蝽可通过上调表达DnaJ基因以应对高温胁迫。

环境温度升高会导致昆虫体内代谢速率加快，从而引起细胞内有毒物质增多（李慧等，2022）。昆虫在环境胁迫下，除了大量热激蛋白表达量发生显著变化外，还有大量解毒酶及相关基因的表达量发生变化。Guo等（2018）发现在高温和农药双重胁迫下，烟粉虱Bemisia tabaci的CYP450及11个解毒酶基因的表达受到影响；Ma等（2019）使蜜蜂Apis mellifera暴露于不同温度（25、30、35、40、45℃）2 h或45℃不同时间（0、0.5、1、1.5、2 h），结果显示蜜蜂CYP450基因表达量随温度的升高及处理时间的延长而提高；Li等（2023）利用RNAi沉默TtCyp3a2和TtCyp4v2的表达后，截形叶螨Tetranychus truncatus的高温耐受性降低，表明TtCYP3a2和TtCyp4v2的表达与高温耐受性密切相关。细胞色素P450是一种重要的抗逆性蛋白酶，在内外源物质的分解代谢中发挥重要作用，存在于昆虫对高温胁迫的生理生化反应中（Li et al.，2023）。此外，UGT在昆虫代谢解毒过程中发挥重要作用，可与CYP450协同排除昆虫体内的外源有毒物质（Xiu et al.，2018；曹景鑫等，2022）。在本研究中，蠋蝽受高温胁迫后CYP450及UGT基因被诱导表达，以提高CYP450及UGT的活性，利于蠋蝽在高温环境下维持正常的代谢水平。

综上所述，本研究在蠋蝽高温处理后的转录组数据中进行分析处理，筛选到编码HSP、DnaJ、CYP450、UGT的基因，这些基因表达受高温诱导，可能在抵御温度胁迫过程中发挥重要作用，为蠋蝽响应极端温度的分子机制研究提供参考。