萤叶甲亚科Galerucinae Chevrolat隶属于鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae，是叶甲科中物种最丰富的亚科，为世界性分布，全世界约543属7 145种（Nie et al.，2017）。该亚科的成虫体型为椭圆形或者圆形，体色多样，部分种类有明艳的金属光泽，较少种类被毛（毛萤叶甲属Pyrrhalta等），触角11节多为丝状，前胸外露，中胸和后胸被鞘翅覆盖，前胸侧板和基前转片合并，鞘翅多光滑，腹部背面可见7节，跗节为拟4节，后足腿节纤细，前足基窝节开放或关闭（Yang et al.，2015）。萤叶甲亚科昆虫的幼虫与成虫几乎都为植食性，且多数具有宿主特异性，该亚科昆虫作为与植物协同演化的典型代表，具有重要的生物学和经济意义（Nie et al.，2018），其物种鉴定与多样性研究的意义超越了传统分类学范畴。一方面，它为阐释生物互作与多样性演化提供了理论模型；另一方面，通过明确种类组成及其寄主专一性，该研究直接为外来入侵物种的风险评估、农林害虫的可持续防控以及区域性生物多样性保护计划的制定，提供不可或缺的科学数据和决策支持。

安徽省地处华东地区，横跨古北和东洋两大地理区系，境内分布着长江和淮河两大主要水系。淮河—长江流域过渡带地处中国东部中纬度地区，位于亚热带与暖温带气候的交汇地带，是古北区与东洋区的典型交汇与过渡地域。该区域呈现出明显的气候、植被与生态系统异质性，孕育了丰富的生物多样性资源，其中昆虫种类已记录约3 300种（孟绪武，2003）。在昆虫多样性方面，萤叶甲亚科作为叶甲科中物种最丰富的类群之一，在安徽省有着重要的研究价值。然而，目前针对该类群的系统分类与多样性调查仍相对缺乏，仅在孟绪武编著的《安徽省昆虫名录》记载有20属37种（孟绪武，2003）。与此同时，该过渡带内古北区与东洋区成分交汇明显，存在大量替代分布与重叠分布现象（张汉鹄，1995）。淮河常被视为东部地区两大区系的重要地理分界线，而长江流域则因其气候和生态条件更为复杂，呈现出更为明显的生物替代与重叠分布格局。历史气候波动和地貌演化进一步影响了该地区生物区系更替、谱系分化与适应性演化，使其成为研究生物地理格局与多样性形成机制的理想区域（Hewitt，2000；Qiu et al.，2011）。

因此，本研究聚焦于安徽省域内的萤叶甲亚科昆虫，旨在整合传统形态特征与DNA条形码数据对该类群进行本底调查，厘清其物种组成、构建其物种的形态学参考库和DNA条形码文库，并进一步结合地理分布信息，探讨该类群的区系构成与演化格局，以期为区域生物多样性保护及昆虫与植物协同演化研究提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   研究样地、标本采集、物种鉴定与形态库的构建

本研究选取安徽省4个代表性的样地（池州市、黄山市、六安市和芜湖市）的24个小样点，包括：池州市：霄坑大峡谷、牯牛降、齐山、太朴山、万罗山、杜村、华阳村、兰溪村、庙前村、牌楼村、青山村、伍村；黄山市：金竹坑、鸡冠山、梨树岭、九砂村、文峰宾馆、翡翠谷、寨西村、山后村、下汪村；六安市：羊杙岭、天堂寨；芜湖市：龙山村。采集时间为2021年3-10月、2022年3-9月、2023年3-8月、2024年1-9月和2025年8月。采集方式包括扫网捕法、马氏网法、飞行阻隔器法、陷阱法和灯诱法，其中扫网捕法和灯诱法的采集频率为一日一次，飞行阻隔器法和陷阱法的采集频率为两日一次，马氏网法的采集频率为六日一次。采集到的样本保存在无水乙醇中，在当日进行简单分类并记录好详细信息，如采集人、采集时间、采集地点、采集方式等。

本研究采用整合分类学方法进行物种鉴定，具体流程如下：首先，根据标本的外部形态特征进行初步鉴定，将形态差异显著的个体界定为不同形态种，并为每个形态种分配实验室编号，随后保存于5℃冰箱中。对每个形态种的背面观利用实验室拍照系统（装配了老蛙FF 100 mm F2.8 CA-Dreamer Macro 2×镜头的佳能ESO 850D单反式相机与Wemacro微距堆叠摄影支架组合）进行拍照，所得图像采用Heliconfocus 8.0软件叠加合成为一张图像并用Adobe Photoshop CC 2024软件后期处理，最终用Adobe Illustrator 2023软件完成图片排版。

传统形态学鉴定由杨星科研究员和包宇共同完成，基于形态种标本、照片及雄性外生殖器（部分形态种）查阅检索表进行鉴定。同时采用分子鉴定方作为辅助手段，对目标样本进行DNA序列测定和分子界定。最终，通过整合形态和分子两方面的证据，对初步界定的形态种进行整合分类学鉴定。

1.2   样本DNA的提取、COI-barcode序列PCR扩增及测序

本研究使用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/基因组织DNA提取试剂盒。依照说明书提取样本总DNA。使用通用引物扩增线粒体COI序列，PCR反应体系配制如表 1所示，扩增所用引物序列详见表 2。

PCR反应程序如下：94℃预变性1 min；随后进行5个循环的扩增（94℃变性1 min，45℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min）；继续运行35个循环（94℃变性1 min，50℃退火1.5 min，72℃延伸1 min）；最后72℃延伸5 min。

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶（以0.5 × TBE缓冲液配制）电泳检测。取3 μL PCR产物上样，在紫外光下观察目标条带。将条带清晰、单一的PCR产物送往通用生物系统（安徽）有限公司，采用Sanger测序法进行双向测序。

1.3   mtDNA COI序列编辑、比对

将公司返还的测序数据导入Geneious Prime 2020.4（Kearse et al.，2012）软件中，对每个样本COI-barcode测得的正反测序结果进行拼接与编辑，最终得到134条安徽省萤叶甲亚科昆虫的COI-barcode序列（详见网络版增强出版材料附件1）。

本研究用于系统发育和区系分析的COI序列数据矩阵构建过程如下：首先，整合Nie等人(2018, 2024)发表的来自古北区、东洋区和秦岭地区189条叶甲科COI-barcode序列，以及作为系统发育骨架树使用的108条同源序列，剔除两者间的31条重复序列后，获得266条非重复序列。随后，将此数据集与本研究新测得的138条序列（萤叶甲亚科134条，跳甲亚科4条）合并，最终得到一个包含404条COI序列的数据集。所有序列均在Geneious Prime软件中使用MUSCLE 5.1（Edgar，2004）进行序列比对，生成一致性序列矩阵，并根据后续建树需求导出相应格式文件。

1.4   物种界定

采用基于距离和基于树两种划分方案进行物种界定，基于距离的划分方案采用以下两种方法：ABGD（Automatic Barcode Gap Discovery）（Puillandre et al.，2012）和ASAP（Assemble Species by Automatic Partitioning）（Puillandre et al.，2021），基于树的划分方案采用以下两种方法：PTP（Poisson Tree Processes）、bPTP（Bayesian Poisson Tree Processes）（Zhang et al.，2013）。

基于134条安徽省萤叶甲亚科昆虫的COI-barcode比对序列，使用IQ-TREE v2.2.0（Minh et al.，2020）软件采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建其系统发育树，保存并输出为Newick格式（用于PTP和bPTP分析）。

使用ABGD软件分析并设置参数为Pmin = 0.001、Pmax = 0.1、Steps = 10、relative gap width（X = 0.8）、选择Kimura（K80）TS/TV 2.0替代模型。ASAP分析的参数设置为Scores kept = 10、Probability = 0.01、Use fixed seed value = -1、选择Kimura（K80）TS/TV 2.0替代模型。PTP与bPTP分析（https://species.h-its.org/ptp/）采用上述IQ-TREE v2.2.0软件构建的系统发育树为输入文件，参数设置为网站默认参数：No.MCMC generations = 100 000、Thinning = 100、Burn-in = 0.1、Seed = 123。

1.5   系统发育树构建

采用骨架树约束法构建系统发育树。该方法以Nie等（2018）基于108条线粒体基因组氨基酸序列利用Phylobayes方法构建的系统树作为骨架树，基于包含404个分类单元的数据矩阵，使用RAxML（Stamatakis，2006）软件在骨架树的约束下构建最大似然法的系统发育树。随后，在FigTree软件中对生成的系统树进行编辑、保存并输出为Newick格式。最后，利用MEGA软件将该系统树导出为无枝长的系统树。

使用PAML软件包中的MCMCTree软件构建分歧时间树（Yang，2007）。采用近似似然计算，具体参数如下：使用“usedata = 3”来进行分歧时间的分析，使用独立速率时钟模型“clock = 2”，生灭过程下的时间先验参数为“BDparas = 1 1 0.1”，平均替代率的参数为“rgene_gamma = 2 5 1”，速率漂移的参数为“sigma2_gamma = 1 10 1”。化石信息源于https://paleobiodb.org/navigator/网站（详见网络版增强出版材料附表 1）。

1.6   区系成分分析

基于六大地理区系（古北区、新北区、新热带区、非洲热带区、东洋区、澳新区）以及秦岭地区和安徽地区，在Excel软件中编制404条序列样本的区系分布表（详见网络版增强出版材料附表 2）并将8个地区按A~H赋予各自的编号及颜色（用于系统发育树编辑）。

本研究使用RASP（Reconstruct Ancestral State in Phylogenies）4.2 beta（Yu et al.，2015）软件，首先移除5个外类群，随后基于BioGeoBEARS包（Matzke，2013）及上述界定的生物地理区系，进行祖先生物地理区域重建。首先，对6种演化模型（DEC、DEC+J、DIVALIKE、DIVALIKE+J、BAYAREALIKE、BAYAREALIKE+J）进行比较评估。根据Akaike信息准则（AIC）和其权重（Akaike weights）进行模型选择，结果显示DIVALIKE+J模型具有最高的校正AICc权重值（AICc-wt，详见网络版增强出版材料附表 3），表明该模型为本研究最佳拟合模型。随后，在BioGeoBEARS软件包基于DIVALIKE+J模型运行分析，并输出相关结果文件。最后，将phylip格式的系统树文件导入“交互式生命之树”（iTOL）在线平台（Letunic and Bork, 2021），以实验祖先分布区的直观可视。

2.   结果与分析

2.1   安徽省萤叶甲亚科昆虫形态种的图片和DNA条形码参考库构建

本研究基于外部形态特征，初步鉴定出安徽省萤叶甲亚科昆虫134个形态种。对所有形态种均拍摄高清晰的背面观图像，经标准化处理并剔除一些重新鉴定的形态种后，构建了其形态学图像参考库（详见网络版增强出版材料附图 5）。

对上述134个形态种样本均成功获取线粒体COI-barcode序列。经校对、拼接与编辑后，构建了最终的数据矩阵，并建立了安徽省萤叶甲亚科的DNA条形码参考文库，该数据已提交至GenBank数据库，登录号为PX804707-PX804840（详见网络版增强出版材料附件1）。该数据矩阵具有以下特征：1）序列结构与长度：所有序列长度为472~1 548 bp，比对后矩阵全长为1 554 bp。序列完整性高，无明显插入/缺失。2）碱基组成：A+T和G+C含量分别为66.8%和33.2%，表现出典型的AT偏向性，符合昆虫线粒体基因组的典型碱基组成特征。3）多态性位点分析：在1 554 bp的比对矩阵中，共检测到689个变异位点，其中580个为简约信息位点。高比例的信息位点表明COI片段在萤叶甲亚科物种水平上具备较强的鉴别能力。

2.2   基于形态和分子数据的整合物种鉴定

本研究综合运用形态学鉴定和分子分类方法，对安徽省萤叶甲亚科的134个形态种进行具体的物种鉴定。杨星科和包宇基于形态种标本、照片及雄性外生殖器（部分形态种）查阅检索表进行鉴定。134个形态种中，91个形态种被鉴定到种级水平（对应58个有效种），37个鉴定至属级水平，另外6个仅鉴定到亚科水平（详见网络版增强出版材料附表 4）。

为了提供分子证据并客观界定物种，本研究基于134条安徽省萤叶甲亚科昆虫的COI-barcode序列采用4种主流方法进行分子物种界定：ABGD分析物种界定结果显示有两个明显的遗传距离间隔区域0.03~0.05和0.06~0.09（详见网络版增强出版材料附图 1），在先验种内差异阈值P为0.0215时，将134个形态种被划分为65个可操作分类单元（OTUs）。ASAP分析检测到一个主要遗传距离间隔区域0.06~0.08（详见网络版增强出版材料附图 2），在遗传距离为0.0839时，同样划分为65个OTUs（详见网络版增强出版材料附表 5，附表 9）。PTP与bPTP分析均将134个形态种划分为81个OTUs（详见网络版增强出版材料附表 6，附表 7）。对比发现，ABGD与ASAP的划分结果（65个OTUs）与形态初步鉴定结果差异较大，且经形态复核发现存在明显的错误合并。PTP与bPTP的划分结果（81个OTUs）与形态学划分更为接近，但仍存在少量错误分组（如过度拆分或合并）。

最终，本研究以形态学鉴定为基础，以PTP/bPTP的分子划分为主要参照，对存在争议的物种逐一进行形态与分子数据的交互验证。经综合研判，确认安徽省萤叶甲亚科共包括33个属78个有效种，其中53种被鉴定至种级水平，包含16个安徽省新纪录属及41个新纪录种（详见网络版增强出版材料附表 8）。该整合分类方法既发挥了分子方法在物种界定中的客观性，亦通过形态学复核纠正了潜在的算法偏差，从而提升了物种鉴定的可靠性。

2.3   安徽省萤叶甲亚科昆虫区系组成及祖征区域重建

该分析中共使用了叶甲科COI-barcode序列399个(不含5个外群)，其中各亚科所含标本数量详见表 3。

根据基于生物地理区重建的系统发育树（图 1），各亚科分类单元的分布与聚类情况如下：肖叶甲亚科Eumolpinae的5个形态种分布于东洋区（O）、古北区（PA）、非洲热带区（AT）、新热带区（NT）及秦岭地区（QINL）。其中分布于秦岭的锯胸叶甲Syneta adamsi未与来自其他地区物种聚为一枝。茎甲亚科Sagrinae仅包含1种紫茎甲Sagra femorata，分布于东洋区（O）。豆象亚科Bruchinae的2个形态种分布于非洲热带区（AT）与秦岭地区（QINL），并聚为一枝。水叶甲亚科Donaciinae的3个形态种分布于新北区（NA）和古北区（PA），并聚为一个进化枝。负泥虫亚科Criocerinae的5个形态种涵盖东洋区（O）、古北区（PA）及非洲热带区（AT），聚为一个单系。彩斑叶甲亚科Spiloprinae仅1个形态种，分布于澳洲区（AA）。龟甲亚科Cassidinae的12个形态种分布于东洋区（O）、古北区（PA）、非洲热带区（AT）、新北区（NA）及新热带区（NT），聚为一个单系群。隐肢叶甲亚科Lamprosomatinae仅1个形态种分布于东洋区（O）。隐头叶甲亚科Cryptocephalinae的16个形态种分布于东洋区（O）、古北区（PA）、非洲热带区（AT）及秦岭地区（QINL），聚为一个进化枝。叶甲亚科Chrysomelinae的14个形态种全部分布于古北区（PA），且聚为一枝。跳甲亚科Alticinae分布最为广泛，115个形态种涵盖东洋区（O）、古北区（PA）、新北区（NA）、新热带区（NT）、非洲热带区（AT）及安徽省（AH）。

图  1  基于399条叶甲科COI条形码序列构建的系统发育树及其区系组成分析

Fig.  1  Phylogenetic tree reconstructed from 399 chrysomelid COI barcode sequences, with associated faunal composition analysis

下载: 全尺寸图片

基于COI序列构建的系统发育树中，224个分类群的拓扑结构显示，部分萤叶甲亚科Galerucinae与跳甲亚科Alticinae的形态种呈现交叉分布格局，除去这些嵌合分布的分类单元，并排除一个镶嵌于肖叶甲亚科Eumolpinae的丽柱萤叶甲Gallerucida gloriosa外，其余萤叶甲亚科Galerucinae物种均聚于一单系群。该亚科的区系组成如下：东洋区（O）33种（14.73%）、古北区（PA）17种（7.59%）、安徽省（AH）134种（59.82%）、新北区（NA）3种（1.34%）、新热带区（NT）1种（0.45%）及秦岭地区（QINL）36种（16.07%）。进一步分析显示，来自安徽的134个形态种中，有124个物种（划分为38个支系）聚类于东洋界分支中；其余10个物种（归属于6个支系）则与古北界支系聚在一起。

3.   结论与讨论

3.1   安徽省萤叶甲亚科物种多样性的重新评估与提升

本研究通过广泛的采样与整合分类学鉴定，共记录安徽省萤叶甲亚科昆虫33属78个有效种。与孟绪武编著的《安徽省昆虫名录》和《中国叶甲科名录》统计结果相比，本研究新增了安徽省新纪录16属、41种，详见表 4。这一结果表明，安徽省作为中国东部重要的生物地理过渡带，其萤叶甲亚科的物种多样性在历史记录中被严重低估。本研究结果与早期调查数据之间的差异，一方面反映出历史研究在采样广度和深度上的不足，另一方面也强烈提示该地区可能蕴藏着大量未被描述的分类单元。

3.2   DNA条形码与分子界定在解决复杂分类问题中的效力

本研究采用形态学结合DNA条形码（COI）的整合分类策略，成功界定了78个有效种，其中53个鉴定至种级水平。研究结果再次证实了DNA条形码技术在解决形态近似种（Morphologically similar species）和隐存种（Cryptic species）鉴定中的有效性。然而，本研究也揭示了一个严峻的挑战：尚有43个形态种未能匹配到已知的物种名称，同时，仅有部分序列在公共数据库（如BOLD和GenBank）中获得高相似度的比对结果。这凸显出，目前数据库中关于中国萤叶甲亚科分子参考序列，尤其是针对安徽地区类群的序列，仍较为缺乏。这43个未匹配形态种的存在暗示了两个可能性：一是它们是尚未被描述的新种；二是它们是已知物种，但缺乏分子数据参考。因此，未来的工作重心不应仅限于标本采集，更应致力于构建和完善区域性的昆虫DNA条形码参考库，以解决关键形态特征缺失导致的鉴定难题。

本研究证实，基于COI条形码的bPTP和PTP物种界定方法是解决形态分类学难题的强力工具，特别是在处理种内形态多态性（Intraspecific polymorphism）和隐存种（Cryptic species）复合体时表现出极高的稳健性。首先，该方法有效剔除了体色变异对分类的干扰，将形态差异显著但遗传背景高度一致的个体正确归并。例如，细刻丝萤叶甲Sphenoraia micans、黑带波萤叶甲Brachyphora nigrovittata、丽柱萤叶甲Gallerucida gloriosa以及水杉阿萤叶甲Arthrotus nigrofasciatus等物种，尽管其样本间存在明显的体色或斑纹差异（详见网络版增强出版材料附图 3），但序列相似度均在98.9%~99.8%之间，被bPTP模型准确聚类为同一物种。其次，在区分形态极度近似的物种方面，分子数据提供了决定性证据。例如，形态难以区分的拟守瓜属未定种Paridea sp.2与Paridea sp.3，以及长跗萤叶甲属未定种Monolepta sp.1与筒节长跗萤叶甲Monolepta arundinariae（详见网络版增强出版材料附图 4），其序列相似度分别仅为91.7%和91.5%，远低于种内变异阈值（通常为98%），从而被有效界定为独立物种。此外，对于印度黄守瓜、异跗萤叶甲及二纹柱萤叶甲等类群的成功聚类，进一步支持了在分类学实践中以形态学为主体、辅以分子证据进行验证的“整合分类学”策略的必要性。

尽管整合形态与分子证据的策略在本研究中成效显著，但这些未能鉴定的类群也突显了当前研究所面临的双重障碍：在形态学层面，部分关键鉴定特征（如生殖器结构）在早期文献中描述缺失或模糊；在分子层面，公共数据库中缺乏本地区或近缘类群的权威参考序列，限制了DNA条形码的鉴定效力。此外，作为单一的线粒体标记，COI基因的母系遗传特性使其在处理近期分化或可能存在杂交渐渗的类群时具有一定局限性。因此，为了更准确地解析系统发育关系、界定物种边界并揭示隐藏分类单元的多样性，未来的研究需进一步整合多基因数据（如16S rRNA、Ef1α等），构建多标记联合的证据体系，从而为该类群的分类学与系统学研究提供更可靠的基础。

3.3   安徽省萤叶甲亚科昆虫具有典型的东洋区系特征与“由南向北”的扩散性

基于物种分布数据的区系分析显示，安徽省萤叶甲亚科昆虫中，东洋区成分占据绝对优势，比例高达92.54%。安徽省地跨淮河，通常被视为古北区与东洋区的过渡地带。然而，本研究中接近93%的东洋区成分表明，至少在萤叶甲亚科这一类群中，安徽省的区系性质表现出强烈的热带/亚热带亲缘性。这可能是由于萤叶甲亚科昆虫多通过取食植物叶片为生，其分布受到寄主植物分布及水热条件的严格限制，从而表现出更明显的趋暖性。

更有趣的是，结合初步的系统发育分析发现，这些分布于安徽的东洋区物种在进化树上多占据基部位置，暗示其保留了较原始的遗传特征。据此，本研究推测安徽省现存的萤叶甲亚科区系起源于东洋区，其当前的分布格局是历史上种群由南向北扩散并适应本地环境的结果。为了验证这一假说，未来的工作需要构建包含更多类群和基因位点的高分辨率系统发育树，并结合化石记录或分子钟校准点估算主要支系的分化时间。通过在时空框架下重建其生物地理历史，本研究将能够明确各类群的迁入、迁出及本地分化事件，从而更完整地揭示中国东部过渡带昆虫多样性形成的动态过程。

附录：附件1 134条安徽萤叶甲亚科COI-barcode序列

附表1 MCMCtree软件构建分歧时间树所用化石信息

附表2 404条COI条形码序列信息

附表3 PASP软件的六种演化模型评估结果

附表4 安徽省萤叶甲亚科昆虫采集信息

附表5 ABGD分析与ASAP分析的物种划分结果

附表6 PTP分析物种划分结果

附表7 bPTP分析物种划分结果

附表8 整合形态学与条形码技术的鉴定结果

附表9 基于134条COI-barcode序列的ASAP物种界定10个最佳分区

附图1 基于134条COI-barcode序列的ABGD物种界定分析距离直方图

附图2 基于134条COI-barcode序列的ASAP物种界定分析距离直方图

附图3 具多态性的同物种形态照

附图4 形态相似的不同物种形态照

附图5 安徽省萤叶甲亚科昆虫背面观图版（I~ⅩⅤ）

详细数据见网络版增强出版材料（http://hjkcxb.alljournals.net/）