棺头蟋属Loxoblemmus Saussure，1877隶属于直翅目、蟋蟀总科、蟋蟀科、蟋蟀亚科。它广泛分布于亚洲、澳洲、非洲，全世界共计61种，其中中国记述18种（Cigliano et al., 2025），接近三分之一。棺头蟋属物种有别于其他属的独特之处在于，它们的面部平截，雄虫尤其明显，这也就是它的属名中loxo前缀的意思——倾斜的。

由于棺头蟋在中国分布广泛，国内对其的分类学研究展开较早。殷海生和刘宪伟（1995）对中国棺头蟋属14个种进行形态学鉴定，并给出了雄性成虫检索表。尤平等（1997）调查了陕西等地的蟋蟀昆虫共37种，其中包括棺头蟋6种，并给出了其雄性成虫的检索表。张东晓（2018）考察了云南蟋蟀物种及其地理分布，记录了棺头蟋10种，并给出了其雄性成虫检索表。此外，近些年还有学者发表过国内的2种棺头蟋新种，L. montanus Liu et al., 2016和L. rectilineus Qiao et al., 2020。此外，也有学者如谢令德和郑哲民（2001）比较了棺头蟋属4种蟋蟀音锉形态，认为石首棺头蟋L. equestris和附突棺头蟋L. appendicularis的音锉比较近似，哈尼棺头蟋L. haanii和多伊棺头蟋L. doenitzi的音锉比较近似。上述所有的研究均是基于形态学特征，鲜有学者对于之前分类的标准及有效性提出过质疑。然而，He和Takeda（2014）通过饲养实验，报道了尖角棺头蟋L. angulatus的面部多型问题，认为棺头蟋颊部的突起并非是一个可靠的分类学特征，而是会随个体大小而改变。因此，过去及如今的基于棺头蟋形态的分类学研究可能一直存在问题。

除了形态学分类之外，也有研究者基于分子学对国内的棺头蟋进行分类学研究。尤平和郑哲民（2001）分析了中国5种棺头蟋属昆虫的核型，得出窃棺头蟋L. detectus、多伊棺头蟋、哈尼棺头蟋的进化距离较近的结论。李恺等（2003）运用RAPD技术对中国常见的9种棺头蟋属昆虫的亲缘关系进行了研究，其结果与尤平等人的结果相似。邓素芳（2006）基于Cytb基因对棺头蟋属7个种构建了系统发育树，结果显示泰康棺头蟋L. taicoun和石首棺头蟋是比较基部的类群，支持哈尼棺头蟋和窃棺头蟋分别为两个种的观点，但对于附突棺头蟋及小棺头蟋L. aomoriensis的分类地位与李恺等（2003）略有差别。

随着DNA条形码的发展，通过COI基因序列进行昆虫分类，已在不少昆虫类群中证实了其可行性（Hebert et al., 2004；Ball et al., 2005；Janzen et al., 2005；Monaghan et al., 2005；Huang et al., 2013；Ashfaq et al., 2014；Hendrich et al., 2015），也已经在其他蟋蟀类群的分类学研究中得以应用（Allegrucci et al., 2014；Liu et al., 2018；Li et al., 2021；Zhao et al., 2022），但是到目前为止，还未对棺头蟋开展过相关研究。本研究通过测序27个中国棺头蟋个体的COI基因序列，结合NCBI数据库中已有的棺头蟋序列，构建棺头蟋属中部分物种的系统发育关系，初步探究了棺头蟋的分类情况。

1.   材料与方法

1.1   供试昆虫及处理

本研究所用样品在野外采集时均保存于65%酒精。带回实验室后，利用昆虫针在泡沫板上对昆虫进行固定和整姿，使其呈自然状态，取下标本的右后足，浸入装有无水酒精的1.5 mL EP管中，在-40℃冰箱冷藏保存，虫体与右后足均进行统一编号。棺头蟋样品信息见表 1。分类鉴定主要依据殷海生和刘宪伟于1995年编著的《中国蟋蟀总科和蝼蛄总科分类概要》以及后续发布的中国棺头蟋文献资料（殷海生和刘宪伟，1995；尤平等，1997；Liu et al., 2016；张东晓，2018；Qiao et al., 2020）。雄性外生殖器解剖方法：将标本腹部末端浸泡在热水中0.5 h还软，掀开下生殖板后，用镊子或者解剖针将部分骨化的生殖器取出。为了更好地观察其骨化特征，可将解剖后的生殖器置于5~10% NaOH中适宜时长，待肌肉组织消解后，用清水清洗，再放入盛有甘油的150 μL离心管中保存，与标本插在同一枚昆虫针上。

1.2   DNA提取、PCR扩增及测序

测序方法：样品取自浸泡在无水乙醇中的后足股节肌肉，使用AXYGEN试剂盒，参照使用说明提取棺头蟋样品的基因组DNA，后保存于-20℃。COI基因的扩增引物为COBL：5'-TYTCA ACAAAYCAYAARGATATTGG-3'；COBU：5'-TA AACTTCWGGRTGWCCAAARAATCA-3'（潘程莹等，2006），由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。PCR反应体系为50 μL，2 × Taq MasterMix 25 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 19 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；35个循环包含94℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸8 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测阳性后由北京擎科生物科技股份有限公司上海分公司进行双向测序。所测样品序列已上传GenBank数据库。

1.3   序列数据处理

使用ATGC 7.0.2软件对27个本研究棺头蟋样品测序结果的ab1文件进行序列拼接和人工校正，在NCBI数据库中检索得已发表的14条棺头蟋属的COI序列，并将一条迷卡斗蟋Velarifictorus micado的COI序列作为外群（表 2），与27个样品序列导入MEGA 7.0软件。将序列方向调整为一致后，使用MEGA 7.0内置的ClustalW软件进行多序列比对，去除两端突出序列，得到658 bp的基因序列并保存为fasta格式，通过DAMBE v7.3.32软件检测核苷酸饱和度（Xia，2018），如果Iss的值小于Iss.c，说明序列间的替换没有达到饱和，这些序列可以用于后续的分析，结果表明核苷酸替换程度并未饱和（Iss = 0.127，Iss.c = 0.805），确认数据可用于系统发育关系分析。

1.4   系统发育树构建

通过PhyloSuite 1.2.3软件对42个COI基因数据按照5 Invertebrate mitochondrial code table进行提取（Zhang et al., 2020）。使用PhyloSuite1.2.3软件内的IQ-TREE（Nguyen et al., 2015）进行基于最大似然法（Maximum likelihood，ML）的分析（Anisimova et al., 2011），最适模型为边缘链接分区模型（Edge-linked partition mode），bootstrap分析选择Ultrafast（Minh et al., 2013），10 000次bootstrap重复，分析结果通过Interactive Tree Of Life（iTOL）v6（Letunic and Bork, 2024）可视化。

1.5   分子物种界定分析

本研究使用以下两种物种界定方法：

（1）ASAP（Assemble Species by Automatic Partitioning）物种界定分析基于SPARTExplorer（https://spartexplorer.mnhn.fr/delimitation）的ASAP模块进行分析（Puillandre，2021；Miralles et al., 2022），将比对后不含外群的COI数据集传入网站，参数设置为：核苷酸替代模型选择Kimura（K80），Split groups below this probability = 0.001，Number of best scores = 10，Fixed seed value = -1。

（2）PTP（Bayesian Poisson Tree Processes）物种界定分析（Zhang et al., 2013）基于bPTP平台（https://species.h-its.org/ptp/）完成，上传COI基因系统发育树文件，具体参数设置为：选择有根树（Rooted），MCMC运行100 000代，在结果中去除外群，其余按照默认参数设置, 最终输出基于最大似然法的PTP结果。

2.   结果与分析

2.1   形态学鉴定结果

形态学鉴定结果位于棺头蟋样品信息中物种名称处（表 1）。

2.2   系统发育树结果

基于COI序列，以迷卡斗蟋V. micado作为外群构建的棺头蟋属的最大似然法（ML）系统发育树显示，不同物种大多各自聚为独立分支，且分支间具有较高的支持率，与形态学所界定的物种大体一致。部分类群如多伊棺头蟋L. doenitzi，哈尼棺头蟋L. haani和窃棺头蟋L. detectus聚为1支，泰康棺头蟋L. taicoun分化为2个支系（图 1）。

图  1  基于COI基因构建的棺头蟋属Loxoblemmus系统发育树及其物种界定结果

注：分支节点处的数值表示Ultrafast Bootstrap（UFBoot）支持值，UFBoot ≥ 95视为具有显著支持；11个MOTUs为PTP分析结果，10个MOTUs为ASAP分析结果。

Fig.  1  Molecular phylogeny and species delimitation in the genus Loxoblemmus based on the COI gene

Note: Branches with Ultrafast Bootstrap (UFBoot) support values ≥ 95 were considered significantly supported. The 11 Molecular Operational Taxonomic Units (MOTUs) were delineated by PTP analysis, and the 10 MOTUs by ASAP analysis.

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2.3   物种界定结果

基于COI基因，利用两种分子物种界定分析方法（ASAP和PTP）对41个棺头蟋个体进行物种界定分析。ASAP结果为10个MOTUs，PTP结果为11个MOTUs。小棺头蟋L. aomoriensis（MOTU1）、石首棺头蟋L. equestris（MOTU3）、巨首棺头蟋L. macrocephalus（MOTU11），其个体均被归入单一MOTU，支持形态学分类结果；多伊棺头蟋L. doenitzi、哈尼棺头蟋L. haanii和窃棺头蟋L. detectus被归于MOTU2；泰康棺头蟋被归于两个MOTU（MOTU4，MOTU5）；ASAP结果中介棺头蟋和附突棺头蟋被归于1个MOTU，而在PTP结果中介棺头蟋L. intermedius（2081）和附突棺头蟋L. appendicularis（1589）被归于MOTU9，介棺头蟋（3333）和附突棺头蟋（453，4113，1152）被归于MOTU10（图 1）。

3.   结论与讨论

本研究首先对27个棺头蟋样品进行形态学鉴定，将27个样品为9个形态种，而在基于COI基因通过ASAP法和PTP界定方法中被分别分为7和8个MOTUs，这与形态学结果不完全重合。系统发育树中，石首棺头蟋与泰康棺头蟋聚为1支，表明二者间亲缘关系较近，与邓素芳的研究结果相同（邓素芳，2006）；小棺头蟋和多伊棺头蟋聚为一大支，说明二者间亲缘关系较近，与前人研究结果一致（尤平和郑哲民，2001；李恺等，2003；邓素芳，2006）。泰康棺头蟋在分子物种界定结果中被分为2支，分别采自四川汶川（3149，3150）和云南保山（653，654），两者中是否含有隐存种或因地理隔离导致分化，有待进一步研究。

本研究中传统的形态学分类手段与分子生物学手段在物种鉴定结果上并不完全一致。在前人的研究中，区分附突棺头蟋和尖角棺头蟋L. angulatus主要根据颜面的侧突：侧突显著超过复眼的个体为尖角棺头蟋，侧突短不超过复眼的个体为附突棺头蟋（Shiraki，1930；Bey-Bienko，1956；殷海生和刘宪伟，1995），后来有学者通过对尖角棺头蟋的饲养实验，报道了尖角棺头蟋的颜面多型问题，尖角棺头蟋的颜面发育程度受环境影响，也存在侧突不超过复眼的个体，说明附突棺头蟋的侧突存在不同发育程度多型的情况（He and Takeda, 2014），因此之后有学者提出尖角棺头蟋是附突棺头蟋的同物异名（He，2018）。介棺头蟋的颜面侧突程度介于雅棺头蟋L. jacobsoni和石首棺头蟋之间，不超过复眼或无三裂（Chopard，1929；殷海生和刘宪伟，1995；张东晓，2018）。本研究将侧突发育程度高，侧突尖端靠近或超过复眼的个体鉴定为附突棺头蟋，将侧突发育程度低的个体鉴定为介棺头蟋。然而形态学鉴定结果在分子学结果中被分为2支，附突棺头蟋和介棺头蟋相互混合，说明出现鉴定错误。我们认为是由于这2种蟋蟀的雄性成虫颜面形态均具有种内个体差异，附突棺头蟋的个体差异已被证明（He and Takeda, 2014），而本研究中雄性介棺头蟋也存在侧突发育程度高的个体，其侧突尖端也可到达复眼附近，说明目前依靠颜面特征的形态学分类无法准确地区分这两种蟋蟀，需要寻找其它的分类学特征。

同样，在形态学上区别多伊棺头蟋、窃棺头蟋和哈尼棺头蟋主要根据颜面侧突的发育情况，侧突显著超出复眼的个体被鉴定为多伊棺头蟋，侧突不超出复眼时再根据额突形态区分窃棺头蟋和哈尼棺头蟋（Saussure，1877；Stein，1881）。本研究中经形态学鉴定后的多伊棺头蟋、窃棺头蟋和哈尼棺头蟋在分子生物学方法中被分为一支，该结果说明这些个体应该为同种。暂将其归为多伊棺头蟋，其成虫头部形态具有种内个体差异，即头部侧突不仅存在显著超过复眼的情况，也存在侧突不超过复眼的情况，但在以往的形态分类学中，侧突较小的多伊棺头蟋会被鉴定为哈尼棺头蟋或窃棺头蟋，说明颜面特征无法作为分类特征以区分这3种蟋蟀。因此，以往根据颜面形态得出的窃棺头蟋和哈尼棺头蟋在中国的分布为错误记录，应将窃棺头蟋和哈尼棺头蟋在中国的名录中暂时剔除。

蛮棺头蟋KM362659（Kang et al., 2016）在系统发育分析中与本研究中的多伊棺头蟋聚为一支，而二者在形态学上存在显著差异，雄性蛮棺头蟋触角基节均具有齿状突起（Gorochov and Kostia, 1993），而多伊棺头蟋成虫（包含本研究中所有多伊棺头蟋个体）触角基节均无突起（Stein，1881），建议重新检视该个体的标本。

本研究证实了部分蟋蟀物种的分类学特征不稳定，很可能产生错误鉴定的情况（He and Takeda, 2014；He，2018；Guo et al., 2024），揭示了中国棺头蟋属物种分类的复杂性和潜在的问题。