随着分子生物学技术的飞速发展，DNA条形码技术已在生物多样性研究中占据重要地位（Ratnasingham and Hebert, 2007；Pečnikar and Buzan, 2014)。截至2025年2月，在NCBI（National center for biotechnology information）网站上登记的DNA条形码数据已达到63 901 138条，在生命条码数据系统（Barcode of life data system，BOLD）中登记的物种超过20 253 000条（https://boldsystems.org/）。在众多候选基因中，线粒体细胞色素C氧化酶I亚基基因（COI）因其相对保守，且具适度变异性、母系遗传（Sato and Sato, 2013)、核苷酸提取率高（Strueder-Kypke and Lynn, 2010)等特点，已成为目前动物物种界定（Species delimitation）的理想基因（Waugh，2007）。目前DNA条形码技术作为一种标准、快捷、低成本的物种界定方法，也被应用在分类学之外的多个领域，如食品生产监管、生物保护、外来入侵物种检测等（Armstrong and Ball, 2005；王慧等，2023）。

然而，不同的算法可能得到不同的操作分类单位（Operational taxonomic units，OTUs），因此DNA条形码数据分析方法的选择对物种界定的结果具有重要影响。目前基于遗传距离和基于系统发育树的方法是条形码物种界定研究中常用的方法。其中基于遗传距离的方法通常需设定阈值（Threshold）相似度以区分种内与种间差异：如自动条形码差距发现（ABGD，Automatic barcode gap discovery）方法是通过检测种内和种间距离差异分布中的差距来确定阈值，从而实现物种界定（Puillandre et al., 2012）；jMOTU（Java-based molecular operational taxonomic units）法是依据用户选定的截断值（cut-off）范围生成多个分子可操作分类单元（MOTU），并在阈值前进行聚类分析，以区分不同阈值集下的种内和种间变异（Jones et al., 2011）。基于系统发育树的方法在物种界定中也广泛应用，该方法通常需构建超度量树（Ultrametric trees）、最大似然树（Maximum parsimony tree，MP树）和邻接树（Neighbor-joining tree，NJ树）等不同类型的系统发育树，随后通过分析系统发育树的拓扑结构和分支长度进行物种划分：如bPTP模型便是基于系统发育树的物种界定方法，其通过统计物种形成事件在进化树上的分布概率（Probability distribution）来划分分子操作单元（Zhang et al., 2013）。

不同算法在不同类群中的物种界定结果存在差异。Ratnasingham和Hebert（2013）曾将jMOTU、ABGD和GMYC三种算法应用到蜜蜂、鸟类、鱼类、尺蛾、夜蛾、蝴蝶等类群，结果显示GMYC方法准确率最高（89.0%），其次为ABGD（85.2%）和jMOTU（74.3%）。在鳞翅目科级水平的研究中，如草螟科Crambidae，DNA条形码利用ABGD算法取得了与形态鉴定结果完全一致的成功率（杨聪慧等，2013）。然而，在夜蛾科Noctuidae的研究中，虽然jMOTU和ABGD方法整体划分效果较好，但在某些近缘物种上仍与形态学分类结果存在较大分歧（宋韶彬等，2014）。

刺蛾科Limacodidae隶属于鳞翅目Lepidoptera斑蛾总科Zygaenoidea，是鳞翅目较为基部的类群，目前全世界已知301属1 672种（Liang et al., 2024）。我国刺蛾科昆虫种类丰富，已记录64属230种，占世界种类的20%以上（Jiao et al., 2019）。刺蛾科幼虫体表常生有枝刺与毒毛，接触皮肤可引发红肿剧痛及皮炎，故俗称“痒辣子”或“刺毛虫”（Powell，2009；杨乐乐等，2022）。刺蛾科昆虫是桃、杏、茶等重要经济作物和行道树的重要害虫，暴食期虫口密度大时可吃光叶片，严重威胁植物生长（Murphy and Lill, 2010）。提升昆虫物种界定准确率，有助于增强害虫防治的精确性（Xia et al., 2018）。目前，国内针对刺蛾科昆虫的DNA条形码物种界定算法比较研究较少，本研究将多种广泛使用的DNA条形码物种界定方法应用于刺蛾科昆虫物种界定中，旨在为对后续刺蛾科昆虫的多样性基础调研和农林害虫防治提供参考。

1.   材料与方法

1.1   数据来源

本研究基于公共数据库与课题组采集样本的条形码序列，整合为刺蛾科昆虫DNA条形码数据集。其中公共数据库部分共获取有效序列4 351条，包括NCBI网站收录1 515条序列（对应818种单倍型），BOLD数据库中2 836条序列（对应2 094种单倍型）。此外，本团队通过系统采样，于中国华北的6个代表性地理点位（表 1）共采集刺蛾科成虫标本231头，经形态学鉴定后成功获取COI序列212条（单倍型163种）。

样本采集使用夜间高压汞灯诱集法，捕获后立即使用毒瓶处死。挑选部分形态完整的标本制作针插标本及外生殖器玻片，用于形态学物种鉴定。其余样本带回实验室后，储存于-20℃冰箱中，以备后续DNA条形码提取。所有标本均存放于首都师范大学生命科学学院遗传进化与多样性课题组，并进行形态鉴定。最终共鉴定出21属40种，用于后续研究。

1.2   数据处理

1.2.1   样品DNA提取、COI片段扩增及测序

样本取后足约20 mg，用Biomed组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒（天根生化科技有限公司）进行昆虫全基因组的提取，COI基因扩增采用引物LCO1490与HCO2198，目标片段为658 bp线粒体COI 5'端序列。PCR反应体系为25 μL，包含2 × Mastermix 12.5 μL、10 μmol/L正反向引物各0.5 μL、模板DNA 2.5 μL及ddH₂O补足体积。扩增程序设置为：94℃预变性2 min；40个循环包括94℃变性20 s、54℃退火20 s、72℃延伸45 s；终延伸72℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，并委托北京中科西林生物技术有限公司使用ABI 3130xl全自动测序仪进行双向测序。

1.2.2   原始数据校对

测序获得的原始COI条形码序列通过Chromas软件（v2.6.6）进行质量校正和序列拼接（http://technelysium.com.au/wp/chromas/），通过BLAST与NCBI数据库进行同源性比对，排除非目标序列干扰（Clewley，1995）。为验证序列编码区完整性，采用MEGA v11.0软件将每条序列按无脊椎动物线粒体密码子表翻译为氨基酸（Tamura et al., 2021），确认无提前终止密码子（TAA/TAG/TGA异常位点）。

所有序列经格式转换与冗余过滤，剔除长度不足500 bp或含模糊碱基（N）比例 > 1%的序列。筛选后的序列通过ClustalX（v2.1）获得对齐后的刺蛾科昆虫COI序列数据集（Larkin et al., 2007）。比对结果导出为FASTA格式，用于后续遗传多样性分析和系统发育树构建。

1.3   数据分析

1.3.1   条形码数据集遗传多样性分析

利用S_PIDER R包（v3.0）对COI条形码单倍型序数据集进行碱基组成和遗传多样性分析（Brown et al., 2012）。使用base.freq函数计算序列碱基组成（A/T/C/G频率）；利用GC.content函数确定GC含量，以评估序列的碱基组成特征。为识别序列中的保守位点和变异位点，采用seg.sites函数进行统计分析。核苷酸多样性通过nuc.div{pegas}函数计算，使用titv{spider}函数以计算转换与颠换比率。此外，为进行DNA条形码间隔区分析，利用S_PIDER包的dist.dna函数计算K2P遗传距离，绘制刺蛾科昆虫种内和种间遗传距离分布图。

1.3.2   刺蛾科昆虫系统发育树重建

基于刺蛾科COI条形码单倍型数据集，选择斑蛾科Zygaenidae、鞘蛾科Coleophoridae及卷蛾科Tortricidae）中3个物种作为外群，采用贝叶斯推断法（BI）构建系统发育树。数据预处理阶段，利用DAMBE 7.0软件对COI序列进行替换饱和度检验（Xia and Xie, 2001），通过检验后利用PhyloSuite v1.2.3的ModelFinder模块（BIC准则）筛选最佳核苷酸替代模型（GTR+G+I模型）重建刺蛾科昆虫BI树（Zhang et al., 2020）。

1.3.3   多种物种界定算法比较

基于jMOTU的物种界定方法分析：利用jMOTU软件对样本进行可操作分类单元划分，划分到同一MOTU内的样本被认定为同一物种（Jones et al., 2011）。将比对后的刺蛾科昆虫COI数据集导入程序后，设置分歧阈值（cut-off）为1~50 bp（对应遗传距离0.15%~7.60%），以探索不同阈值下的分子可操作分类单元（MOTU）划分。参数配置包括：聚集相似性阈值（Low BLAST identity filter）设为97%，最小序列长度百分比（Minimum sequence length）设为95%（保留≥625 bp序列），通过内置MEGA BLAST算法进行序列聚类。

基于ABGD的物种界定方法分析：基于条形码间隙的假设（即种内差异小于种间差异），ABGD程序首先基于初始距离分布划分假设物种群，随后根据假设物种的分组进行递归计算迭代优化分组，直至无法优化为止（Puillandre et al., 2012）。该方法通过ABGD在线平台（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/）实现。将刺蛾科COI序列比对后的数据集以FASTA格式提交至服务器，并逐一设置先验种内遗传距离范围（Pmin=0.001，Pmax=0.1）、相对间隙宽度（X=1.5），采用Kimura 2-parameter（K80）模型计算遗传距离，转换/颠换比率（Ts/Tv）固定为0.9以适配刺蛾科线粒体进化特征。

基于bPTP模型的物种界定方法分析：bPTP模型基于系统发育分支长度界定物种，通过统计物种形成事件在进化树上的分布概率划分分子操作单元（Zhang et al., 2013）。本研究将生成的树文件上传至bPTP在线平台（https://species.h-its.org/ptp/），参数设置为有根树、排除外群、MCMC迭代50万次、老化比例10%，其余为默认参数（Zhang et al., 2020）。

2.   结果与分析

2.1   分类信息和序列特征

本研究共获得刺蛾科条形码序列4 563条，涵盖176个形态学物种，单倍型总数达3 075种。序列长度为558~757 bp，序列中各碱基组成分别为A（30.88%）、T（38.52%）、G（15.87%）、C（14.73%），A+T总含量（69.40%）显著高于G+C含量（30.60%），与昆虫线粒体基因的碱基偏好性一致。位点变异分析显示，658个位点中保守位点（C）123个（占18.69%），变异位点（V）418个（占63.52%），其中简约信息位点（PI）294个（占44.75%），单态性位点（S）118个（占17.90%）。基于K2P模型的遗传距离分析表明：种内遗传距离范围为0.15%~10.40%（平均值为5.27%），种间距离为5.15%~18.22%（平均值为12.55%），转换/颠换比率（Ts/Tv）为80%。基于COI序列分析发现刺蛾科昆虫种内种间未存在明显的DNA条形码间隔区，表明在本研究类群中物种界定较为困难（图 1）。

图  1  鳞翅目刺蛾蛾昆虫DNA条形码空白区

Fig.  1  DNA barcoding gap in Limacodidae species

下载: 全尺寸图片

2.2   系统发育树分析

自2003年提出后，DNA条形码在物种界定方面的有效性，已在多个类群中得到证实；但单一短片段线粒体COI基因序列在解决属级及以上高级阶元的系统发育关系尚存在一定争议（Ahrens et al., 2007）。为评估线粒体COI基因序列基因片段在属水平上的系统发育分辨率，本研究从刺蛾科昆虫条形码数据集中随机获取2 512条序列用于构建贝叶斯物种树（图 2）。结果表明，刺蛾科类群可分为6个主要支系：绿刺蛾支系（Parasa-lineage）、线刺蛾支系（Cania-lineage）、冠刺蛾支系（Phrixolepia-lineage）、扁刺蛾支系（Thosea-lineage）、Alarodia支系（Alarodia-lineage）和姹刺蛾支系（Chalcocelis-lineage），其中64%的形态学物种形成高支持率单系群（Bootstrap≥75%），表明COI条形码序列对物种具有较好的界定能力，支持COI序列在种级分类中的有效性。尽管COI序列在种级水平表现良好，然而支系内部部分属间的拓扑结构仍不清晰（Bootstrap < 50%），例如赭眉剌蛾Narosa ochracea与喜马钩纹刺蛾Atosia himalayana表现为姊妹群，而并未与其属其他个体聚为一支，这表明COI条形码在刺蛾科昆虫物种界定中仍存在一定局限性，选择科学的物种界定算法对于解决这一问题至关重要。

图  2  基于条形码构建的鳞翅目刺蛾科昆虫贝叶斯物种树

Fig.  2  Bayesian species tree of Limacodidae species constructed with COI barcode dataset using BEAST

下载: 全尺寸图片

2.3   不同物种界定算法结果比较

2.3.1   基于jMOTU的物种界定结果

刺蛾科分子序列差异截取值（Cut-off value）与可操作分类单元数（MOTUs）的分析结果如图 3所示。结果表明MOTU数目未出现明显的富集平台，曲线在24~39 bp（3.65%~5.93%)的序列差异内变化缓慢，划分MOTUs范围为148~248。同一物种被划分在同一个MOTU则为成功，在MOTUs数为41、bp数为32的平台上，2 512条序列中有1 577条按一同物种划分到同一MOTU中（成功率为62.78%），与形态学分类结果相比，jMOTU方法较为保守，低估了物种划分数目。

图  3  分子序列差异截取值与可操作分类单元数目的关系

Fig.  3  Relationship between cut-off value and the number of MOTUs

下载: 全尺寸图片

2.3.2   基于ABGD的物种界定结果

以0.001~0.1的先验值P区间对刺蛾科样本进行分组，结果包含了初始划分（Initial partition）和递归划分（Recursive partition）两种情况（图 4）。其中，初始划分情况下物种界定结果较为稳定，2 512个样本被分成了362组；而递归划分情况结果则随着阈值有所变化，先验值在0.0017~0.0028时将样本分成了442组，在0.0028~0.0210时样本分组数目逐渐降低至297组。当阈值达到0.1000时，所有数据被划分为1组，此时的值已经超过种间最小遗传距离，将所有物种视为1组。因此选择先验值P为0.0215时，观察同一个物种被划分在同一组中，得到该方法界定物种成功率为84.49%。与形态学分类结果相比，ABGD方法高估了物种划分数目。

图  4  ABGD划分结果

Fig.  4  Automatic partition results of dataset by ABGD method

下载: 全尺寸图片

2.3.3   基于bPTP的模型物种界定结果

基于最大似然法和贝叶斯法的系统发育树进行物种界定，得到了一致的结果，bPTP模型在刺蛾科COI数据集上界定出364个分子物种单元（MOTUs）远大于传统分类结果（176个形态学物种），其中仅60.01%与形态学物种匹配，后验概率支持率≥0.9的节点占67.17%。bPTP的两种物种界定结果均存在将原本属于一个物种的不同地区的个体划分为不同物种的现象，表明bPTP方法在对刺蛾科昆虫进行物种界定时存在过度划分的问题。

2.3.4   不同物种界定方法结果比较

比较多种物种界定方法的物种界定准确率，结果表示不同界定方法在准确率上存在显著差异（图 5）。ABGD方法界定准确率（84.49%）显著高于jMOTU的平均物种界定准确率（62.78%），bPTP方法的平均物种界定准确率最低，为60.01%。

图  5  刺蛾科物种界定性能（准确度）比较

Fig.  5  Comparison of species delimitation performance (accuracy) for the Limacodidae species

下载: 全尺寸图片

此外，在刺蛾科昆虫物种界定方法的结果在不同属间存在差异，特别是绿刺蛾属Parasa昆虫，该属昆虫的种间遗传距离较小，物种界定存在较大困难（图 6-A）。绿刺蛾属昆虫的种间（红色）和种内（蓝色）遗传距离分布存在高度重叠，但部分物种界定方法在绿刺蛾属昆虫中仍表现出较高的准确性（图 6-B）。ABGD方法的准确率最高，为93.79%，能够克服种间和种内遗传距离较小带来的挑战，具有较好的适用性；jMOTU则显著较低（82.01%），这可能与它们在处理种间和种内遗传距离较小时的局限性有关，而bPTP方法的准确率最低，为66.63%。

图  6  绿刺蛾属物种界定性能（准确度）比较

Fig.  6  Comparison of species delimitation performance (accuracy) for the Parasa

下载: 全尺寸图片

3.   结论与讨论

本研究基于大规模刺蛾科COI条形码数据集（4 563条序列，涵盖176个形态学物种），系统评估多种分子物种界定方法（如jMOTU、ABGD、bPTP模型）在刺蛾科分类中的适用性。结果表明，COI序列在刺蛾科种级分类中具有较高有效性，64%的形态学物种在系统发育树中形成高支持率单系群，支持其作为物种鉴定的核心标记（Hebert et al., 2003）。物种界定方法比较表明，ABGD方法综合表现最优（平均准确率84.49%），而bPTP模型因过度划分遗传变异导致准确率最低（60.01%）。ABGD方法在界定物种时能基于条形码间隙理论建立的递归优化机制，通过自动检测种内和种间遗传距离分布的临界点，无需预设固定阈值即可适应不同属群的遗传变异模式（Paz and Crawford, 2012；Pentinsaari et al., 2017）。不仅如此，ABGD方法采用两阶段递归划分策略，初始阶段通过先验距离快速识别潜在物种单元，递归阶段则逐步收紧阈值实现分组优化，能够有效降低因种内距离异质性导致的误判风险（Yu et al., 2015）。在物种分化时间较短或基因流频繁的情况下，核密度估计法（Kernel density estimation）通过识别种内/种间遗传距离分布的临界点，能够更准确地优化递归算法，减少人工误判（Ko et al., 2025）。bPTP模型在刺蛾科昆虫物种界定中存在过度划分现象，这可能是由于bPTP模型基于系统发育分支长度界定物种，倾向于将种群间的遗传分化误判为物种间的分化（Katouzian et al., 2016）。尤其在绿刺蛾属等种内分化显著的类群中，地理隔离或生态适应性分化可能加剧单系群误判，这与Blair在角蜥科中的发现类似（Blair and Bryson, 2017）。

刺蛾科种内与种间遗传距离的重叠现象，可能与隐存种复合体有关。隐存种复合体作为导致遗传距离重叠的关键因素，已在多个类群中得到充分证实。例如，烟粉虱Bemisia tabaci隐存种间的遗传距离远大于种内变异，导致距离分布出现显著重叠（Wang et al., 2025）；扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis被识别出存在约3% K2P遗传距离的隐存谱系（Chu et al., 2009）；蒋学龙团队对亚洲鼩鼹Uropsilus等小型哺乳动物的研究则进一步证实基于形态学定义的单一物种内部可能存在着多个深度的系统发育支系（Wan et al., 2013）。隐存种复合体的存在会导致种内遗传距离的显著增大（Korshunova et al., 2019）。而种内遗传距离接近甚至超过部分种间距离时，会导致基于单一遗传距离阈值的物种界定方法准确率的降低（Jörger et al., 2012），如jMOTU方法在本研究中对刺蛾科物种划分成功率仅为62.78%，ABGD方法虽然通过递归优化分组在一定程度上缓解了单一阈值的问题，但仍存在高估物种数目的倾向。

绿刺蛾属的种间遗传距离均值为6.8%，而部分种内遗传距离高达10.4%，表明传统基于遗传距离的物种界定方法在该属中可能难以有效区分不同物种，这与早期形态学研究揭示的绿刺蛾种间特征重叠、种界模糊等鉴定困境形成相互印证（Solovyev，2011）。在处理这类复杂类群时，仅依靠一个条形码片段序列可能无法有效区分某些近缘物种或隐存种，多基因或基因组数据的整合能够提供更全面的遗传信息，如核基因标记（如ITS、EF-1α）或全基因组数据（Zhang and Hewitt, 2003）。不仅如此，生态位建模（Ecological niche modelling）可以结合环境变量与物种分布数据，预测物种的潜在分布范围（Stohlgren et al., 2006），将生态位建模与DNA条形码技术相结合，能够为物种鉴定提供多维度的证据支撑。例如，在条形码序列存在单系分支但形态诊断特征模糊的情况下，生态位分化程度可作为物种划分的补充判据（Hawlitschek et al., 2011；Yang et al., 2024）。此外，几何形态学数据与分子数据的结合，能提供更全面的分类证据，减少单一数据源的误判风险（Cannon and Manos, 2001）。同时，自适应算法深度学习模型能够通过训练大量数据，自动界定遗传距离与物种分化之间的关系，如卷积神经网络（CNN）或循环神经网络（RNN）可以用于分析DNA序列数据，识别种内与种间遗传距离的复杂模式，进而提升物种界定的准确性（Yang et al., 2022；Zhao et al., 2023）。通过整合多维度数据，以提升刺蛾科及其近缘类群的物种界定精度，为生物多样性监测与保护提供更可靠的技术支撑（Persello et al., 2022）。

附录：附表 1   本研究COI序列信息及数量

详细数据见网络版增强出版材料（http://hjkcxb.alljournals.net）