Investigating the glucolipid metabolism of diapause in Microplitis mediator based on transcriptome sequencing
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摘要:目的
通过分析中红侧沟茧蜂Microplitis mediator正常发育阶段的蛹和滞育准备阶段的蛹的转录组数据，本研究初步筛选出参与滞育期间能量代谢的相关基因并研究。
方法利用Illumina HisSeq 2000平台对中红侧沟茧蜂正常发育阶段和滞育准备阶段的蛹进行转录组测序分析，明确了中红侧沟茧蜂正常发育（ND）蛹与滞育准备阶段（DP）蛹之间的转录组数据差异，筛选出参与糖代谢、脂代谢的关键基因，并挑选出其中的10个基因进行RT-qPCR验证。
结果ND vs DP富集到139 437个差异表达基因，主要富集在参与糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、脂肪酸降解以及半乳糖代谢等信号通路上。ND vs DP最富集的GO条目为GO: 0005488，被注释为结合功能。共有7 436个基因在此条目下富集。根据富集结果筛选出了10个参与糖代谢和脂代谢相关基因，其中参与海藻糖分解的TRE、参与糖原合成的GS和参与TCA的IDH在滞育准备阶段的蛹内的表达量显著高于正常发育阶段的蛹，参与海藻糖合成的TPS和参与TCA循环的FH在滞育准备阶段蛹内的表达量低于正常发育的蛹的表达量；参与脂肪酸代谢与合成的ACOT、ADH、GPAT、FAR和MAGL的表达量在滞育准备阶段的蛹内均高于正常发育的蛹。
结论本研究根据转录组的结果，分析筛并筛选出10个滞育期间参与糖代谢及脂代谢的相关基因，为后续的研究提供了理论依据。
Abstract:AimThrough transcriptomic analysis of Microplitis mediator pupae during the normal developmental stage (ND) and diapause preparation stage (DP), we preliminarily identified and investigated key genes involved in energy metabolism during diapause.
MethodsUtilizing the Illumina HiSeq 2000 platform, transcriptomic sequencing and analysis were performed on ND and DP pupae. Differences in transcriptomic data between the two stages were identified, key genes involved in carbohydrate and lipid metabolism were screened, and 10 of these genes were selected for RT-qPCR validation.
ResultsA total of 139 437 differentially expressed genes (DEGs) were identified from the ND vs DP comparison. These were primarily enriched in signaling pathways such as glycolysis/gluconeogenesis, starch and sucrose metabolism, fatty acid degradation, and galactose metabolism. The most significantly enriched Gene Ontology (GO) term was GO: 0005488, annotated as "binding, " which encompassed 7 436 genes. Based on the enrichment results, 10 candidate genes associated with carbohydrate and lipid metabolism were selected. Among these, the expression levels of TRE (involved in trehalose degradation), GS (involved in glycogen synthesis), and IDH (involved in the tricarboxylic acid (TCA) cycle) were significantly higher in DP pupae compared to ND pupae. Conversely, the expression levels of TPS (involved in trehalose synthesis) and FH (involved in the TCA cycle) were lower in DP pupae. Additionally, genes involved in fatty acid metabolism and synthesis, including ACOT, ADH, GPAT, FAR, and MAGL, exhibited higher expression levels in DP pupae than in ND pupae.
ConclusionBased on the transcriptome results, this study analyzed and screened 10 key genes involved in carbohydrate and lipid metabolism during diapause, providing theoretical insights for subsequent research in this field.
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昆虫在面对不良环境条件，如低温、高温、干旱和食物短缺时，表现出生命活动停滞和新陈代谢下降，这种现象被称为滞育（王满囷和李周直，2004；Numata et al.，2023）。滞育能够帮助昆虫度过不良的环境，提高昆虫的存活率。外界的光照和温度等环境因素往往会对昆虫是否进入滞育起到关键性作用，其主要会在分子层面上对昆虫产生一系列的影响，诱发昆虫滞育发生的分子级联系统，从而使昆虫进入滞育（冯嘉伟等，2023）。同时昆虫可以提前预测外界不利环境因素的到来，感知外界环境条件的变化（徐卫华，2008；Teets et al.，2023），提前贮存能量物质以准备滞育，并且在滞育过程中降低能源物质的消耗以满足滞育结束后的生命活动所需（Hahn and Denlinger，2011；Teets et al.，2023）。昆虫如果在进入滞育之前未能准备好足够的能源物质或在进入滞育后缺乏维持能源物质的储存，都会导致滞育提前终止甚至造成个体的死亡（任小云等，2016；罗小燕和胡林超，2024）。因此对于昆虫滞育期间能量物质代谢的研究尤为重要。
中红侧沟茧蜂Microplitis mediator属膜翅目Hymenoptera茧蜂科Braconidae，广泛分布于欧亚的多个国家和地区，是多种鳞翅目害虫的寄主（刘小侠等，2004）。在我国，中红侧沟茧蜂主要分布在华北地区，主要寄生棉铃虫Helicoverpa armigera、粘虫Mythimna separata、小地老虎Agrotis ipsilon、斜纹夜蛾Spodoptera litura等的低龄幼虫（秦启联等，2000；李建成等，2004；李建成等，2005；李建成等，2010）。中红侧沟茧蜂为低温短日照滞育型昆虫，当温度在16℃且光周期为L∶D = 10∶14时，滞育率可达98%以上（浑之英等，2005；李文香等，2008），但在全暗或全光照下即使低温也不进入滞育（李文香等，2008）。近年来，对于中红侧沟茧蜂的滞育类型、滞育光周期、母代滞育反应和滞育过程能量物质变化的研究等取得了一定的成果（浑之英等，2005；李文香等，2010；路子云等，2014），但是有关调控中红侧沟茧蜂滞育的分子机制仍不明确。
组学的发展为昆虫滞育的研究提供了新的手段。通过转录组测序分析，比较正常发育与滞育发育的黑腹果蝇Drosophila melanogaster的基因表达谱发现，参与调节代谢的AKH信号通路的相关基因在滞育的黑腹果蝇个体中显著上调表达，通过激活磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）或腺苷酸活化酶（Adenylyl cyclase，AC）来刺激滞育期间的糖原分解（Kučerová et al.，2016）。有研究通过分析滞育的二斑叶螨Tetranychus urticae的转录组和蛋白质组，鉴定出65个Ca2+结合蛋白基因和23个Ca2+转运蛋白基因存在显著变化，说明Ca2+在滞育调控中具有实质性作用（Zhao et al.，2017）。通过差异分析白蛾黑棒啮小蜂Tetrastichus septentrionalis的转录组数据，发现KEGG注释结果的差异基因主要富集在碳水化合物代谢和脂类代谢等方面，并且在滞育期间海藻糖含量显著积累，提高了小蜂在滞育期间的耐寒性（史俊瑞，2023）。在茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes的非滞育和滞育蛹中，其主要的差异基因富集在糖酵解/糖异生、淀粉与蔗糖代谢和柠檬酸循环这三条途径上，其中参与碳水化合物途径的代谢对茶足柄瘤蚜茧蜂的滞育起着重要作用（刘敏等，2021）。通过iTRAQ技术分析烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis滞育相关的蛋白质差异表达，发现参与脂质运载/胞质脂肪酸结合蛋白在滞育期间显著上调表达（黄凤霞等，2015）。
本研究对中红侧沟茧蜂正常发育阶段的蛹（Normal development pupa，ND）和滞育准备阶段的蛹（Diapause preparation pupa，DP）进行转录组测序，并进行生物信息学分析，筛选出参与能量物质代谢，即糖代谢和脂代谢相关的基因，并进行实时荧光定量分析验证。为进一步研究中红侧沟茧蜂滞育调控的基因和相关的分子机制奠定了基础，为中红侧沟茧蜂滞育的人工调控技术提供了理论支持。
1. 材料与方法
1.1 供试昆虫
中红侧沟茧蜂来自于中国科学院动物研究所实验室，以粘虫幼虫为繁育寄主，寄主稳定饲养5代以上。正常发育的蜂蛹获得：将正常发育的中红侧沟茧蜂与寄主粘虫共同放置于（24 ± 1）℃，L∶D = 14∶10，相对湿度50%的环境条件下饲养，按寄生蜂∶寄主= 1∶50的比例进行接蜂，寄生24 h。将被寄生蜂寄生后的粘虫放置在（24 ± 1）℃的环境下饲养7 d，当寄生蜂的老熟幼虫从粘虫体内钻出，结出绿色的正常发育茧时立即收集，经过液氮处理后放置于-80℃保存备用。中红侧沟茧蜂滞育条件的设置参考中国科学院动物研究所实验室内的滞育蜂的饲养方法，其寄生蜂的寄生阶段处理和正常发育组一致。待寄生蜂充分寄生完粘虫后，将粘虫转移到（16 ± 1）℃，L∶D = 10∶14，相对湿度50%的条件下，发育约15 d，观察到寄生蜂从寄主体内钻出，结出褐色的滞育茧，迅速收集。将滞育茧用液氮处理，放置于-80℃保存备用，获得滞育的寄生蜂蛹。
1.2 转录组测序、组装和基因功能的分类
中红侧沟茧蜂的正常发育、滞育的蛹的测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。每个样本3个生物学重复，利用TruseqTMRNA试剂盒，构建cNDA文库，采用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台进行转录组测序，对获得的原始数据进行过滤，去除接头序列和低质量的序列，最终获得高质量序列，再利用Trinity软件对获得的高质量序列进行组装和拼接，最终获得unigene。
1.3 差异基因的分析和注释
使用DESeq2软件，对正常发育蛹和滞育蛹（ND vs DP）的基因表达量进行分析。对于这些基因的筛选条件为|Log2（fold change）| ≥ 1（Fold change，FC，指基因表达水平的变化倍数）。对于差异表达基因的矫正采用P值筛选，筛选的标准为P < 0.05，P值越低，这些基因的表达水平的差异就越大。使用R软件的数据包对筛选出的基因进行GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，以校正后P值≤ 0.05为显著富集的通路。
1.4 差异基因的筛选
为了确定中红侧沟茧蜂滞育期间负责脂质和碳水化合物代谢的基因，根据常见的物种参与调节脂质代谢和碳水化合物代谢的相关基因（黑腹果蝇、家蚕Bombyx mori、埃及伊蚊Aedes aegypti、赤拟谷盗Tribolium castaneum、烟蚜茧蜂、异色瓢虫Harmonia axyridis、毁侧沟茧蜂Microplitis demolitor等）。从NCBI上下载这些物种的参与脂代谢、糖代谢的蛋白质序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/），并建立蛋白质数据库。利用本地BLASTp软件分别与上述物种的相关基因的蛋白质数据库进行比对，在转录组文件中筛选出相关的糖代谢、脂代谢基因。采用DESeq2分析ND、DP和DT间的差异表达基因，结合P-value和FPKM值，以P < 0.05，且|log2 fold change| > 1的条件筛选出差异表达基因（Dfferentially expressed genes，DEGs），P-adjusted越小，表示差异越显著。其中：
$$ \text { FPKM }=\frac{\text { cDNA Fragments }}{\text { Mapped Fragments (Millions) × Transcript Length }(\mathrm{kb})} $$ 1.5 差异表达基因的RT-qPCR验证
根据1.4筛选出的相关基因进行qRT-PCR的验证，包括参与糖类物质代谢的：海藻糖酶基因（Trehalase，TRE）、海藻糖合成酶基因（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）、异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase，IDH）、糖原合成酶基因（Glycogen synthase，GS）、延胡索酸水合酶基因（Fumarate hydratase，FH）；参与脂类物质代谢的：酰基辅酶a硫酯酶基因（Acyl-coenzyme A thioesterase，ACOT）、乙醇脱氢酶基因（Alcohol dehydrogenase，ADH）、脂肪酰基还原酶基因（Fatty acyl-CoA reductase，FAR）、甘油-3-磷酸酰基转移酶基因（Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）、单酰基甘油脂肪酶基因（Monoacylglycerol lipase，MAGL）。内参基因为核糖体蛋白（Ribosomal protein S3，RPS3）。使用Primer Premier 6.0设计引物，引物序列如下表 1，引物的合成由华大六合（北京）有限公司合成。采用SYBR green PCR Master Mix（Tiangen, China）在StepOne Software v2.3上进行实时荧光定量实验。PCR反应体系（20 μL）为：2 × SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μM）1 μL，cDNA模板2 μL，50 × ROX Reference Dye 2 μL，ddH2O 4 μL。qPCR反应流程如下：95℃ 5 min循环1个，95℃ 5 s、60℃ 15 s循环40个。收集实时定量PCR数据并导出至EXCEL进行分析。qPCR数据收集至EXCEL中，采用2-ΔΔct方法进行分析数据处理，计算相对基因的表达量。
表 1 本研究引物信息Table 1 Primer information in this study基因Gene 正向引物（3’-5’）Forward primer 反向引物（5’-3’）Reverse primer TPS CAAGTGGGTGGAACGACA GGGGCTCAGTGAATGACA TRE AAAGAAACAGCGAAAGGA GAATAAGTAGGGGAGGTTG FH CGTCAAGCAAGAATGAAGGC GGTTCACTTAATGGTCTCGGATAG GS CGATTACCTGATGCTATGG CGTCAACGACGTTATGTG IDH TGACTCGGTAGCTCAAGGTTA CTGTTGGTATTGACGGAAGTG ACOT CGGTCAATGCAAAGCAGAAT GGTCAAAAGTGCGTAAGTGG ADH AGTGAGAAATTTTCTGGCTAAAAGT GAATAGTTTCCCCATTGAGCAG FAR TGGAATGGATGGACGATGAC AACTAAACCCTCGGATAGCG GPAT ACAATTTGCTTCGGCTGACC TTGGCCTTCTGGACCATCTC MAGL CGTCAATAAACGACCAAGCG AGTTTTCAAAGGAGGGCAGA RPS3 AGAAATGCCTCCCACTGCTA GTCCCCAAGGAATGAACTGC 2. 结果与分析
2.1 转录组测序结果
通过对中红侧沟茧蜂正常发育蛹（Normal development pupa，ND）和滞育准备期蛹（Diapause preparation pupa，DP）的转录组测序，本研究获得了6个样本的高质量数据，数据总量达到45.73 Gb。每个样本平均产生了7.62 Gb的clean data，且Q30得分均不低于89.95，表明测序质量较高（表 2）。此外，对ND和DP两个发育阶段的6个样本进行PCA分析，结果显示样本重复性良好，不同组间的样本差异显著，进一步证实了测序数据的可靠性（图 1）。
表 2 样品测序质量评估表Table 2 Sample sequencing quality evaluation样品
Sample原始序列
数据
Raw reads过滤后序列
数据
Clean reads序列个数与序列长度乘积
Clean bases碱基错误率（%）
Bases error ratePhred大于20的碱基占比（%）
Q20Phred大于30的碱基占比（%）
Q30碱基G和C占比（%）
GC contentND_A 55 863 082 53 569 768 8.04 G 0.02 96.51 91.47 36.75 ND_B 57 684 360 55 371 196 8.31 G 0.01 97.62 94.00 37.01 ND_C 527 55 020 50 976 336 7.65 G 0.02 96.59 91.39 38.97 DP_A 444 54 434 43 631 578 6.54 G 0.02 96.07 90.09 37.20 DP_B 536 02 744 52 629 112 7.89 G 0.02 96.01 89.95 37.05 DP_C 507 13 752 48 657 416 7.30 G 0.02 97.36 93.43 37.12 
图 1 中红侧沟茧蜂蛹的转录组主成分分析Fig. 1 Principal component analysis (PCA) of transcriptome data of Microplitis mediator pupa
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使用Trinity对这些clean data进行组装，分别得到191 983 016个Transcripts和163 852 421个Unigenes。其中最长序列长度为29 993（Transcripts）和29 993（Unigenes），N50分别为1 628 nt（Transcripts）和1 952 nt（Unigenes）（表 3）。
表 3 转录组数据组装结果统计表Table 3 Statistics of transcriptome assembly最短序列长度
Min length平均序列
长度
Mean length中位序列
长度
Median length最长序列
长度
Max length不小于总长50%的拼接转录本的长度
N50不小于总长90%的拼接转录本的长度
N90总核苷酸数
Total length (nt)转录本
Transcripts201 837 395 29 993 1 628 294 191 983 016 单基因簇
Unigenes201 1 175 686 29 993 1 952 495 163 852 421 2.2 差异表达基因的注释
本试验对中红侧沟茧蜂两个样本转录组的unigene在不同数据库中进行注释分析。结果显示，共有62 008个unigenes被注释到NT数据库中，占比最高，达到44.47%。其次是NR数据库，注释到49 795个unigenes，占比35.71%；GO数据库注释到44 383个unigenes，占比31.83%；PFAM数据库注释到44 090个unigenes，占比31.62%。这些结果表明，中红侧沟茧蜂转录组的unigenes在多个数据库中均得到了较高比例的注释，为后续功能分析提供了可靠的数据基础（表 4）。
表 4 基因注释成功率统计表Table 4 Gene annotation success rate statistics注释数据库
Datebase注释Unigene数目
Annotated unigene number占总注释unigene百分比（%）
PercentageNR 49 795 35.71 NT 62 008 44.47 KO 25 125 18.01 SwissProt 40 425 28.99 PFAM 44 090 31.62 GO 44 383 31.83 KOG 25 291 18.13 2.3 差异表达基因的GO功能分类
通过对注释到的基因进行GO（Gene ontology）功能分析，本研究发现所有unigene均被归类到三大功能类别中：生物学过程（Biological process）、分子功能（Molecular function）和细胞组分（Cellular component）。在生物学过程类别中，参与细胞过程（Cellular process）和代谢过程（Metabolic process）的基因注释数量最多，表明这些基因在细胞活动和代谢调控中发挥重要作用。在细胞组分类别中，注释到细胞（Cell）和细胞部分（Cell part）的基因数量最为显著，反映了这些基因主要与细胞结构和细胞器功能相关（图 2）。这些分析结果为进一步揭示中红侧沟茧蜂的基因功能及其在生物学过程中的作用提供了重要依据。
图 2 中红侧沟茧蜂蛹转录组unigene的GO功能分类Fig. 2 GO functional categories for unigenes in the transcriptome of Microplitis mediator pupa下载:
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2.4 差异表达基因的GO富集分析
在对ND vs DP的DEGs进行GO富集分析发现，其差异表达基因主要富集在13个分子功能上。生物过程在6个项目上富集，而细胞组分只在3个项目上表现出富集。最显著富集的条目是GO: 0042302，被注释为角质层的结构成分（Structural constituent of cuticle）。富集基因数量最多的GO条目是GO: 0005488，被注释为结合功能（Binding）。共有7 436个基因被富集在此条目下，与DP组相比，有3 395个基因上调表达。上调基因主要参与物质代谢活动（Substance metabolism activities）（图 3）。
图 3 中红侧沟茧蜂蛹ND vs DP DEGs前20条GO条目富集圈Fig. 3 Enrichment circles of the top 20 GO terms of DEGs from ND vs DP transcriptome in Microplitis mediator pupa下载:
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2.5 差异表达基因的KEGG富集分析
对中红侧沟茧蜂ND vs DP的DEGs进行KEGG富集分析，发现DEGs主要富集在与物质代谢相关的通路中，其中有26个基因富集在糖酵解/糖原异生途径（Glycolysis / Gluconeogenesis）中。此外，KEGG富集分析还揭示了正常发育的蛹与滞育准备阶段的蛹差异基因还在淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）以及半乳糖代谢（Galactose metabolism）通路中富集。在滞育准备阶段，参与半乳糖代谢和脂肪酸降解（Galactose metabolism and fatty acid degradation）的基因表达显著增加。这表明，在滞育准备阶段，寄生蜂体内开始大量合成参与物质代谢的蛋白质，最终导致能量物质的积累（图 4）。
图 4 中红侧沟茧蜂蛹ND vs DP的DEGs的KEGG代谢通路富集Fig. 4 Enrichment analysis of KEGG pathways of DEGs from ND vs DP in Microplitis mediator pupa下载:
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2.6 DEGs的定量验证
为了验证转录组测序结果的准确性，本研究基于GO富集分析和KEGG富集分析的结果，筛选出与糖代谢和脂代谢相关的10个关键基因，并采用qRT-PCR技术对其表达水平进行验证。qRT-PCR试验结果显示，这10个基因的表达量变化趋势与RNA-seq测序结果高度一致（图 5），进一步证实了转录组数据的可靠性。这一验证结果为后续深入研究糖代谢和脂代谢相关基因的功能及其调控机制提供了坚实的试验依据。
图 5 中红侧沟茧蜂ND vs DP有关糖代谢（A）、脂代谢（B）基因定量结果注：采用T-test对ND和DP组数据进行差异显著性分析（***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P < 0.05）Fig. 5 Quantitative qPCR validation of genes related to carbohydrate metabolism (A) and lipid metabolism (B) between ND vs DP Microplitis mediatorNote: Differences between ND and DP groups were determined by T-test (***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).下载:
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3. 结论与讨论
本研究对中红侧沟茧蜂正常发育的蛹和滞育准备阶段的蛹进行了转录组的测序和分析，获得了高质量的转录组数据。通过对数据进行分析和筛选，挖掘出了参与糖代谢、脂代谢的关键基因，并对这些基因进行验证。为后续对中红侧沟茧蜂滞育相关的关键因子研究提供了保障。
海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate synthetase，TPS）是海藻糖合成中的必需酶，在调节昆虫生理和行为的各个方面（生存、蜕皮、蛹变态和几丁质代谢）中发挥着至关重要的作用（Wang et al.，2021；Kumar et al.，2022）。在柑橘木虱Diaphorina citri中，当TPS基因被敲除时，在干燥胁迫下观察到葡萄糖水平会显着降低，并且导致幼虫死亡率增加。本研究中，正常发育的中红侧沟茧蜂蛹的TPS表达量相较于滞育的蛹更高，在整个滞育期间，TPS的表达量会逐渐下降，呈现出在滞育准备阶段TPS表达量最高的现象。这表明在滞育的开始阶段，蜂蛹就会积累海藻糖，为整个滞育过程中的生命活动提供能量（Liu et al.，2020）。在烟蚜茧蜂也观察到类似的现象，具体表现为在烟蚜茧蜂进入滞育后，滞育早期的TPS表达水平高于滞育终止阶段（Zhang et al.，2020），从而在滞育的一开始就积累海藻糖。对松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi的研究也发现了类似的趋势。在滞育期间，海藻糖酶的表达显着增加，导致海藻糖的分解，分解产生的葡萄糖对于维持松毛虫赤眼蜂滞育期间的生命活动起着至关重要的作用（Zhang et al.，2020）。在本研究的中红侧沟茧蜂中，海藻糖在滞育的早期阶段开始积累，然后在整个滞育时期被用于各种生命活动，这与柑橘大实蝇Bactrocera minax蛹进入滞育后的海藻糖变化趋势类似（王佳等，2018）。在正常发育的蛹中，TPS的表达明显高于TRE，海藻糖的分解速率小于海藻糖的合成速率，导致海藻糖的积累。在滞育准备阶段的蛹中，TPS的表达水平低于正常发育的蛹，而TRE的表达水平较高。这导致海藻糖的分解和葡萄糖的积累，从而维持滞育初始阶段的生命活动。
糖原是昆虫的关键代谢和能量来源，对于进入滞育之前能量物质的积累尤其重要（Tolmasky et al.，2001；Liu et al.，2009；Pullin，2013）。糖原合酶（Glycogen synthase，GS）和糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP）作为控制糖原合成和分解的限速酶，对滞育期间的中红侧沟茧蜂糖原的合成和分解具有重要的调控作用。本研究观察到滞育准备阶段的中红侧沟茧蜂中GS表达维持在较高水平，从而促进糖原的积累，以达到在滞育早期积累能源物质的目的。在正常发育的蛹中，GP表达水平超过滞育准备阶段的蛹，且GP水平高于此发育阶段的GS水平，导致正常发育的蛹中，糖原能够高效的合成与分解，从而能够快速利用糖原分解产生的能量用于其他生命活动。在七星瓢虫Coccinella septempunctata中，GS的表达量在冬季滞育开始时显着上升，同时体内总糖和糖原含量也增加（Ren et al.，2015）。在菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis（Hao et al.，2013）和尖音库蚊Culex pipiens（King et al.，2020）中也发现了类似的糖原积累和分解的模式：即GP和GS的表达量都维持在较高的水平，且GP的表达水平高于GS，使得糖原能够进行迅速的合成与分解，从而将糖原分解的能量用于其他生命活动中。三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）是有氧生物普遍存在的代谢途径，也是糖代谢的重要一环。昆虫在进入滞育时会降低TCA循环相关基因的表达，从而降低循环过程中的中间体的产生，减少能量的损耗，以达到保存能源物质的目的，提高滞育期间的存活率（Xu et al.，2012）。但是在中红侧沟茧蜂中，参与TCA循环的异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase，IDH）在滞育期间的表达量反而有所升高，这可能是由于需要产生异柠檬酸盐以用于下一步的生化反应，同时产生NADPH用于滞育期间的生命活动，以维持滞育的进行。
脂质作为重要的储能物质，在昆虫的生长、发育、繁殖、长期飞行和滞育等各种生命过程中发挥着至关重要的作用（Arrese and Soulages，2010；郑天祥等，2017；Kaczmarek et al.，2021）。昆虫需要在进入滞育之前积累大量的脂质来维持滞育（Hahn and Denlinger，2007）。中红侧沟茧蜂的转录组分析表明，只有少数基因（包括FAS、ACC、FAR和GK）参与正常发育过程中的脂质合成。这些基因主要负责脂肪酸和甘油的合成。与正常发育阶段的蛹相比，滞育准备阶段的脂肪酸和甘油合成相关的基因的表达水平较高。同时与脂肪酸合成相关的KEGG富集条目的分析表明，与滞育准备阶段相比，正常发育期间的基因条目数量较少。这种现象可能的原因是，参与正常发育的蜂蛹的脂肪酸合成的酶更加高效，所需的相关基因数量较少。但是在滞育期间，由于较低的温度，需要更多的有关脂肪酸合成与代谢的基因参与。转录组和定量的结果也更加从侧面印证这一点。与之类似的，在七星瓢虫滞育的准备阶段，参与脂肪酸合成的关键酶：乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）和长链脂肪酸辅酶A连接酶（Long-chain acyl-CoA synthetase，ACSL）的表达水平达到峰值。随着滞育的进行，这两个基因的表达水平开始下降（Xiang et al.，2021）。中红侧沟茧蜂在滞育准备阶段的MAGL的表达量维持在较高水平，这导致滞育准备期间大量积累脂质，从而为滞育维持阶段和滞育后的发育提供能量物质。值得一提的是，这些在滞育期间低表达的基因在正常发育和滞育准备阶段具有较低的表达水平，但当滞育接近结束并且个体准备羽化时，它们的表达水平显着升高，脂质的合成和分解开始逐渐活跃。
昆虫滞育是一个复杂的动态过程，涉及的生命活动种类繁多。本研究根据中红侧沟茧蜂的转录组数据，探索了中红侧沟茧蜂在正常发育蛹和滞育准备阶段蛹的糖代谢、脂质代谢相关差异基因的变化。结果表明，中红侧沟茧蜂主要通过在滞育准备阶段上调海藻糖酶的表达水平来分解海藻糖，然后利用海藻糖水解产生的糖原来维持滞育期间的生命活动和能量流动。中红侧沟茧蜂在滞育准备阶段提高参与脂代谢相关基因的表达水平，从而积累甘油三酯来作为抵御低温的抗冻保护剂，并为滞育后的发育提供能源物质同时，本研究阐明了糖代谢和脂质代谢过程中的基因表达水平的变化，为寄生蜂滞育的相关研究提供了理论依据。
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图 1 中红侧沟茧蜂蛹的转录组主成分分析
Fig. 1 Principal component analysis (PCA) of transcriptome data of Microplitis mediator pupa
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图 2 中红侧沟茧蜂蛹转录组unigene的GO功能分类
Fig. 2 GO functional categories for unigenes in the transcriptome of Microplitis mediator pupa
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图 3 中红侧沟茧蜂蛹ND vs DP DEGs前20条GO条目富集圈
Fig. 3 Enrichment circles of the top 20 GO terms of DEGs from ND vs DP transcriptome in Microplitis mediator pupa
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图 4 中红侧沟茧蜂蛹ND vs DP的DEGs的KEGG代谢通路富集
Fig. 4 Enrichment analysis of KEGG pathways of DEGs from ND vs DP in Microplitis mediator pupa
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图 5 中红侧沟茧蜂ND vs DP有关糖代谢（A）、脂代谢（B）基因定量结果
注：采用T-test对ND和DP组数据进行差异显著性分析（***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P < 0.05）
Fig. 5 Quantitative qPCR validation of genes related to carbohydrate metabolism (A) and lipid metabolism (B) between ND vs DP Microplitis mediator
Note: Differences between ND and DP groups were determined by T-test (***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
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表 1 本研究引物信息
Table 1 Primer information in this study
基因Gene 正向引物（3’-5’）Forward primer 反向引物（5’-3’）Reverse primer TPS CAAGTGGGTGGAACGACA GGGGCTCAGTGAATGACA TRE AAAGAAACAGCGAAAGGA GAATAAGTAGGGGAGGTTG FH CGTCAAGCAAGAATGAAGGC GGTTCACTTAATGGTCTCGGATAG GS CGATTACCTGATGCTATGG CGTCAACGACGTTATGTG IDH TGACTCGGTAGCTCAAGGTTA CTGTTGGTATTGACGGAAGTG ACOT CGGTCAATGCAAAGCAGAAT GGTCAAAAGTGCGTAAGTGG ADH AGTGAGAAATTTTCTGGCTAAAAGT GAATAGTTTCCCCATTGAGCAG FAR TGGAATGGATGGACGATGAC AACTAAACCCTCGGATAGCG GPAT ACAATTTGCTTCGGCTGACC TTGGCCTTCTGGACCATCTC MAGL CGTCAATAAACGACCAAGCG AGTTTTCAAAGGAGGGCAGA RPS3 AGAAATGCCTCCCACTGCTA GTCCCCAAGGAATGAACTGC 表 2 样品测序质量评估表
Table 2 Sample sequencing quality evaluation
样品
Sample原始序列
数据
Raw reads过滤后序列
数据
Clean reads序列个数与序列长度乘积
Clean bases碱基错误率（%）
Bases error ratePhred大于20的碱基占比（%）
Q20Phred大于30的碱基占比（%）
Q30碱基G和C占比（%）
GC contentND_A 55 863 082 53 569 768 8.04 G 0.02 96.51 91.47 36.75 ND_B 57 684 360 55 371 196 8.31 G 0.01 97.62 94.00 37.01 ND_C 527 55 020 50 976 336 7.65 G 0.02 96.59 91.39 38.97 DP_A 444 54 434 43 631 578 6.54 G 0.02 96.07 90.09 37.20 DP_B 536 02 744 52 629 112 7.89 G 0.02 96.01 89.95 37.05 DP_C 507 13 752 48 657 416 7.30 G 0.02 97.36 93.43 37.12 表 3 转录组数据组装结果统计表
Table 3 Statistics of transcriptome assembly
最短序列长度
Min length平均序列
长度
Mean length中位序列
长度
Median length最长序列
长度
Max length不小于总长50%的拼接转录本的长度
N50不小于总长90%的拼接转录本的长度
N90总核苷酸数
Total length (nt)转录本
Transcripts201 837 395 29 993 1 628 294 191 983 016 单基因簇
Unigenes201 1 175 686 29 993 1 952 495 163 852 421 表 4 基因注释成功率统计表
Table 4 Gene annotation success rate statistics
注释数据库
Datebase注释Unigene数目
Annotated unigene number占总注释unigene百分比（%）
PercentageNR 49 795 35.71 NT 62 008 44.47 KO 25 125 18.01 SwissProt 40 425 28.99 PFAM 44 090 31.62 GO 44 383 31.83 KOG 25 291 18.13 -
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