温度是影响昆虫生命过程、世代发生和种群进化的重要环境因素（Colinet et al.，2015; Tochen et al.，2016）。在自然界中，昆虫一般都会经历夏秋高温和春冬低温的胁迫。对昆虫来说，短期的极端温度变化可能造成虫体不可逆的生理生化反应，并引起昆虫种群发生变化（丁岩钦，1994；Hallman et al.，1999）。对储粮害虫而言，温度的影响主要体现在害虫的新陈代谢上，只有当虫体处于一定温度范围内时，新陈代谢才能正常进行。而处于不适宜的温度范围内时，储粮害虫体内生理生化反应会被抑制，甚至遭到破坏，影响正常的新陈代谢过程，最终导致虫体死亡（王旭峰，2020）。例如，每天在31℃或33℃经过8 h的处理后麦无网长管蚜Acyrthosiphon dirhodum的繁殖力显著下降（Ma et al.，2004）；南亚实蝇Bactrocera tau在经历8℃ ~ -4℃之间的短期低温胁迫后其生长发育会受到显著抑制（Huang et al.，2020）。在极端高温和低温胁迫下，昆虫通常通过增强个体的耐热、耐寒性来抵抗不利的温度（蒋丰泽等，2015），昆虫个体的耐热、耐寒性是决定昆虫种群能否在特定生态环境中生存繁衍的关键因素之一（Sinclair et al.，2015）。

过氧化氢酶（Catalase，CAT）是生物体内清除H₂O₂最主要的酶，可以维持生物体内氧化还原的平衡并保护生物体避免受到伤害（An & Choi，2010）。在昆虫遭受极端高、低温等环境胁迫时，昆虫体内的氧化还原平衡会被打破，造成活性氧（ROS）的积累，刺激CAT和其他抗氧化酶发生反应（刘井兰等，2006）。CAT可将过量的H₂O₂分解成H₂O和O₂，维持细胞内氧化还原反应的平衡，从而减少来自外界环境胁迫的伤害（Kim et al.，2008）。一些研究表明，CAT还参与调节昆虫的生殖和免疫反应，介导昆虫对病原体的免疫反应和胁迫应答（Molina-Cruz et al.，2008；Diaz-Albiter et al.，2011）。甜菜夜蛾Spodoptera exigua在不同的发育阶段体内CAT的相对表达量不同（胡振等，2011）。小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis Tu幼虫在20℃和28℃高温下12 h内随着胁迫时间延长在CAT的活力逐渐上升，消除了小金蝠蛾幼虫体内大量的H₂O₂，以提高小金蝠蛾幼虫耐高温的能力（张青等，2015）。

嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila，又名纸虱、啮虫，是储粮害虫书虱的一种，隶属于啮虫目Psopotera粉啮亚目Troctomorpha书虱科Liposcelididae（程伟霞等，2003）。该虫属于孤雌生殖，个体微小，耐饥饿能力强，成虫寿命长，单次产卵量大，产卵时间长，繁殖速度较快，发育历期短，在世界范围内广泛发生（Nayak et al.，2014）。嗜卷书虱在储粮害虫中已上升为优势种群，在高温高湿地区危害较大，该虫除了为害面粉外，还会直接破坏稻谷的胚芽和完整麦粒，并且在其大量发生时会使储粮发热，发生结露霉变，难以进行有效控制（果玉茹等，2004；王争艳等，2016；孙翔宇等，2020）。本研究以嗜卷书虱为研究对象，克隆嗜卷书虱体内LbCAT基因，分析该基因序列特征，采用RT-qPCR检测其在短期极端高、低温胁迫下的差异表达，分析其在响应温度胁迫中的作用，进而探索嗜卷书虱对极端温度胁迫的响应机制，为探究嗜卷书虱适应环境胁迫因子的机理，针对储粮害虫制定科学、合理、高效的防治策略提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   供试虫源

嗜卷书虱虫源采集于贵州省毕节市的毕节卷烟厂，将所采嗜卷书虱在人工气候室中以烟叶饲养，饲养条件为：黑暗条件，温度（28±1）℃，相对湿度（80 ± 5）%，并每日定时通过喷壶喷水进行烟叶水分保湿。

1.2   样本处理

选取正常饲养条件（28 ± 1）℃下的嗜卷书虱，分别进行低温（4℃）和高温（42℃）的胁迫处理，处理时间为0 min（CK）、60 min和120 min，每个处理取样30头，重复3次，在胁迫处理期间，除温度外，相对湿度及光照条件等均与正常饲养条件保持一致。

1.3   嗜卷书虱总RNA提取和cDNA合成

使用Eastep^® Super Total RNA Extraction Kit试剂盒（上海普洛麦格生物产品有限公司）来提取嗜卷书虱的总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳和检测RNA的质量，使用超微量紫外分光光度仪（Thermo Fisher Scientific）检测其浓度。按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）的说明书进行cDNA第1链的合成。

1.4   嗜卷书虱LbCAT基因克隆

根据转录组数据获得嗜卷书虱CAT基因核苷酸序列，设计CAT基因的特异性引物CAT1-F/CAT1-R，以提取总RNA反转所得的cDNA第一条链为模板，进行PCR扩增获得。PCR反应体系（25 μL）为：premix Taq（Ex Tap Version 2.0 Plus dye）酶12.5 μL，cDNA模板（200 ng/μL）1.5 μL，正反向引物（10 mmol /L）各1.5 μL，ddH₂O 8 μL。反应条件：98℃ 3 min，98℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 1 min，34个循环；72℃ 5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生物工程有限公司）回收目的片段，连接到pMD^®19-T载体（大连宝生物工程有限公司）并转化到大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞（大连宝生物工程有限公司），挑取单一菌落经PCR检测正确后进行扩大培养，菌液送往上海生工生物有限公司测序。

1.5   嗜卷书虱LbCAT基因的序列分析

利用网站ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析出嗜卷书虱LbCAT基因的开放阅读框；利用软件DNAMAN 6.0对所得基因片段进行拼接，并进行翻译及预测氨基酸序列及序列比对；使用网站ExPASy ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）预测了蛋白质理化性质；使用网站ExPASy prosite（https://prosite.expasy.org/）预测了蛋白质的结构域、家族和功能位点；使用网站NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的Blast工具进行氨基酸的同源性分析；应用软件MEGA 11采用邻接法构建嗜卷书虱LbCAT基因的系统进化树，Bootstrap检验设置1 000次重复。

1.6   嗜卷书虱LbCAT基因的表达分析

取1.2节嗜卷书虱处理材料，采用Eastep^® Super Total RNA Extraction Kit试剂盒提取了总RNA，用HiFi Script cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒将其反转录成cDNA，采用RT-qPCR分析嗜卷书虱LbCAT基因在4℃和42℃的温度胁迫下表达量的变化。根据嗜卷书虱CAT基因的全长序列设计1对定量引物qCAT1-F/qCAT1-R，分别选用β-肌动蛋白（β-actin）基因和α-微管蛋白（α-tublin）基因作为内参基因（表 1），使用TB Green^® Premix Dimer Eraser荧光试剂盒（Takara）进行RT-qPCR，反应体系（20 μL）：cDNA模板2 μL，TB Green Premix 10 μL，上下游引物各1 μL，DeyII 0.4 μL，ddH₂O 6.6 μL。反应条件：95℃ 5 s，54℃ 30 s，72℃ 34 s，进行40个循环。

1.7   数据分析

利用2^－△△CT法（Livak and Schmittgen，2001）对嗜卷书虱LbCAT基因的表达水平进行相对定量分析。试验数据用SPASS 21.0软件中的Duncan氏多重比较对数据进行统计分析。

2.   结果与分析

2.1   嗜卷书虱LbCAT基因克隆以及序列分析

以嗜卷书虱的cDNA为模板，经克隆得到1 693 bp的基因序列，命名为LbCAT（GenBank登录号：OQ938787）。经NCBI分析可知，LbCAT基因的开放阅读框（ORF）为1 404 bp，编码467个氨基酸。经ExPASy ProtParam Tool分析可知，编码蛋白相对分子量为53.63 kDa，等电点（pI）为8.5，带负电荷的残基总数（Asp+Glu）为53个，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）为56个，分子式为C₂₄₂₈H₃₆₅₁N₆₆₇O₆₉₃S₁₁，原子总数为7 450，N末端是M（Met），根据假定残基，推测半衰期为30 h，不稳定性系数为26.49，可以把这种蛋白质归类为稳定蛋白，脂肪系数为66.40，总平均亲水性为-0.620，说明该蛋白为亲水性蛋白。

图  1  嗜卷书虱CAT基因的核苷酸及推导的氨基酸序列

注：起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）用红色斜体表示，近端活性部位标签（26FDRERIPERVVHAKG42）和近端血红素配体标签（316RLFAYADTH324）用方框标注，活性位点残基（H）用加粗标记，近端血红蛋白结合配体（Y）用单下划线标记。

Fig.  1  Nucleotide and deduced amino acid sequences of LbCAT from Liposcelis bostrychophila

Note: The start codon (ATG) and stop codon (TAA) were indicated in red italic text, the proximal active site signature (²⁶FDRERIPERVVHAKG⁴²) and proximal heme-ligand signature (³¹⁶RLFAYADTH³²⁴) were marked with boxes, the active site residue (H) was bolded, and the proximal hemoglobin-binding ligand (Y) was underlined.

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图  2  嗜卷书虱LbCAT基因与其他物种CAT基因的多序列比对

注：CAT来源物种GenBank登录号：嗜卷书虱（OQ938787）；嗜虫书虱（QKR72308.1）；干木白蚁（XP_023702049.1）；长叶异痣蟌（XP_046390887.1）；黄肢散白蚁（AFV36369.1）

Fig.  2  Multiple-sequence alignment of CAT from Liposcelis bostrychophila and other species

Note: Origin species of CAT and their GenBank accession numbers: Liposcelis bostrychophila (OQ938787); Liposcelis entomophila (QKR72308.1); Cryptotermes secundus (XP_023702049.1); Ischnura elegans (XP_046390887.1); Reticulitermes flavipes (AFV36369.1).

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2.2   嗜卷书虱LbCAT系统进化分析

在NCBI中比对并下载啮虫目、直翅目、等翅目、缨翅目等4个目共9种昆虫和外群生物棒足毛络新妇Trichonephila clavipes的CAT氨基酸序列，结合预测的嗜卷书虱氨基酸序列，采用邻接法构建系统发育树。结果显示，系统发育树分成两个大的分支，昆虫纲Insecta先聚为一大总分支，啮虫目、直翅目、等翅目、缨翅目这4个目各聚为一支，与传统昆虫分类学结果一致，而外群生物棒足毛络新妇单独聚为一支（图 3）。

图  3  基于LbCAT氨基酸序列通过邻接法构建的系统发育树

注：基于Bootstrap方法进行1 000次重复计算以评估进化树分支的置信度，分支上的数值表示Bootstrap支持值。

Fig.  3  Phylogenetic tree of LbCAT constructed using the neighbor-joining method based on the amino acid sequences

Note: The phylogenetic tree branch reliability was assessed with 1, 000 bootstrap replicates, and the bootstrap support values were shown on the branches.

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从图中的分类阶元来看，嗜卷书虱与同是啮虫目的嗜虫书虱Liposcelis entomophila聚在同一进化支上，说明其亲缘关系最为接近，与其他目的昆虫亲缘关系较远，与外群生物棒足毛络新妇的亲缘关系最远（图 3）。

2.3   嗜卷书虱LbCAT基因在高、低温胁迫下的表达分析

在4℃低温处理下，与对照相比，嗜卷书虱成虫LbCAT基因在60 min和120 min时表达量出现先升高后下降的趋势，表达量分别为对照的4.07倍和2.99倍（图 4-A）；在42℃高温处理下，嗜卷书虱成虫LbCAT基因在60 min和120 min时的表达量与对照相比均显著升（0 min）（P＜0.05），分别为对照的1.84倍和2.1倍（图 4-B）。

图  4  不同处理时长与温度条件下嗜卷书虱成虫LbCAT的相对表达量

注：A，嗜卷书虱LbCAT基因在4℃低温胁迫不同时长的相对表达量；B，嗜卷书虱LbCAT基因在42℃高温胁迫不同时长的相对表达量。数据为平均值±标准差，柱上的*表示不同处理时间的相对表达量存在显著性差异（*，P＜0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；NS，P > 0.05，Duncan's多重比较）。

Fig.  4  Relative expression levels of LbCAT in Liposcelis bostrychophila adults under different temperature and duration treatments

Note: A, Relative expression levels of the LbCAT gene in Liposcelis bostrychophila adults exposed to 4℃ for varying durations; B, Relative expression levels of the LbCAT gene in Liposcelis bostrychophila adults exposed to 42℃ for varying durations. Data were mean ± SD. * above bars indicated significant difference in the relative expression level between different exposure time (*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; NS, P > 0.05, Duncan's multiple range test).

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3.   结论与讨论

本研究通过RT-PCR技术克隆得到cDNA序列全长为1 693 bp的嗜卷书虱CAT基因，命名为LbCAT，开放阅读框为1 404 bp，编码467个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示，该基因具两个标签性序列：近端活性部位标签（²⁶FDRERIPERVV HAKGAG⁴²）和近端血红素配体标签（³¹⁶RLFAYA DTH³²⁴），这与西花蓟马Frankliniella occidentalis FoCAT研究结果相似（Qin et al.，2017）。由系统发育树可知，嗜卷书虱与啮虫目亲缘关系最为接近，与直翅目、等翅目、缨翅目亲缘关系较为接近，表明CAT基因在进化过程中的保守性较高，这与西花蓟马（Qin et al.，2017）和异色瓢虫Harmonia axyridis（唐斌等，2014）等昆虫的研究一致。

温度是影响其生长、繁殖和分布的最重要的环境变量之一（Worner，1988），而极端温度胁迫会引起昆虫体内发生多种不可逆的生理生化反应，包括活性氧的产生（赵静，2011）。当活性氧积累过多时，导致虫体遭受氧化损伤，细胞功能受到威胁（李毅平和龚和，1998；Martindale and Holbrook，2002）。CAT被认为是清除H₂O₂最主要的酶，对许多重要的生理功能有反应（Jena et al.，2013）。本研究发现，受到短时4℃低温胁迫，嗜卷书虱LbCAT基因的表达量会随处理时间延长而逐渐升高，表明昆虫为了保护自身细胞免受低温胁迫的伤害，在受到胁迫时其保护酶系统的防御能力会增强以提高对胁迫的生理适应（赵静，2011）。这与西花蓟马FoCAT基因的表达量在-6℃处理2 h显著增加相同（Qin et al.，2017）；而在短时42℃高温胁迫下，嗜卷书虱LbCAT基因的表达量随处理时间延长呈先升后降的趋势，这是因为在持续高温的条件下，昆虫细胞内会发生蛋白质变性、酶活性降低、细胞膜损伤等许多反应，细胞需要更多的CAT来保护自己减少这些反应造成的氧化损伤，但是由于环境的不断挑战和需要，昆虫的身体会逐渐适应新的环境条件，使过氧化氢酶降低表达量来有效适应高温环境，从而减少氧化损伤并保证生存。这与粘虫3龄幼虫Mythimna separata CAT基因在不同高温31℃、33℃、35℃、37℃、39℃处理120 min和三叶草斑潜蝇Liriomyza trifolii LtCAT基因在温度33℃处理60 min呈先上升后下降的趋势结果类似（李鸿波等，2018；彭晓莹等，2024）

嗜卷书虱是我国主要的储粮害虫，由于储粮害虫新陈代谢会在谷堆中产生大量的热，当谷堆温度升到很高时，不可避免地加重了害虫的生存压力。而目前国内有关嗜卷书虱响应高、低温胁迫的分子机制研究较少。嗜卷书虱作为我国储粮害虫的优势种群，对如何应对极端温度胁迫的相关机理研究还不完善。本研究初步阐明了LbCAT在响应高、低温胁迫的差异表达，为进一步探索昆虫响应环境胁迫的CAT分子机制奠定了理论基础。