乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）是一种专一性的含锌金属酶，是生物体内重要的中链脱氢还原酶，它与生物的逆境胁迫应答关系密切，并在诸多生物生理生化过程中发挥着至关重要的作用（Danielsson et al.，1994）。Gemma等人研究发现乙醇脱氢酶能以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，催化伯醇和醛间的转化反应，乙醇（CH₃CH₂OH）被氧化为乙醛（CH₃CHO）的同时NAD⁺被还原为NADH（Gemma et al.，2006），生成的NADH随后可以进入细胞内的电子传递链中参与ATP的生成（Castro et al.，2012）。在细胞质中，ADH将乙醇代谢为乙醛，之后乙醛脱氢酶催化乙醛转化为乙酸（CH₃COOH），这一反应也是一个氧化反应，乙醛在此过程中被进一步氧化为乙酸，同时NAD⁺被还原为NADH（刘威等，2014；Katner et al.，2019）。乙醇脱氢酶有ADH1、ADH2、ADH3等多种亚型，不同亚型在不同的组织和物种中具有不同的酶活性和底物特异性（Alaimo et al.，2012；张乐等，2013）。不同亚型的ADH可能对乙醇和其他底物有不同的亲和力（Yu et al.，2011）。张伟等人发现ADH基因在外源性解毒途径中，通过代谢酒精和其他有毒物质来减少其对细胞的毒害，帮助松材线虫克服宿主防御化学物质并在松树树脂管道中生存（Wang et al.，2019；Zhang et al.，2020）。

松材线虫病（Pine wilt disease，PWD）是由松材线虫Bursaphelenchus xylophilus寄生在松树体内而导致松树迅速死亡的一种破坏性林木病害。国家林业和草原局2024年第4号公告显示，我国现有18个省（自治区、直辖市）663个县级行政区报道松材线虫疫情，发病地区最北端已至吉林通化市，最西端已达四川雅安市（https://www.forestry.gov.cn/c/www/gkgjlyjgb/547477.jhtml），致死松树数千万株（叶建仁，2019）。松材线虫病疫情扩散迅速、为害面积广，与松材线虫解毒、逆境调控和生长发育等相关基因有密不可分的关系。在前人研究中，ADH基因家族在线虫的逆境调控中发挥重要作用（Futai，2013；Patananan et al.，2015；Albrecht et al.，2022；Cao et al.，2023）。本研究旨在鉴定松材线虫的ADH基因家族，并分析其基因结构、保守结构域、系统发育树以及在松材线虫不同虫态中的表达模式，为松材线虫基因家族的功能研究奠定理论基础。

1.   材料与方法

1.1   松材线虫ADH基因家族的鉴定

在通过NCBI蛋白数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）中查询并下载秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的ADH蛋白序列，再在数据库中下载获取最新松材线虫全基因组数据（Chelliah et al.，2023）。经本地BlastX比对后获得松材线虫ADH蛋白潜在序列（曹景鑫，2022）。随后在InterPro数据库（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）查询并下载ADH所具有的保守结构ADH_zinc_N（PF00107）的隐马尔可夫模型，使用Hmmer 3.0软件在松材线虫蛋白数据库中检索包含上述两个结构域的候选蛋白序列（Zhao et al.，2024）。在NCBI保守域数据库（CD-Search，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和InterPro数据库分析筛选出的蛋白具有ADH_zinc_N保守结构域，经过去除冗余的序列，最终确定了12个BxADH家族潜在蛋白成员（Cao et al.，2023）。

1.2   松材线虫ADH基因家族与其他线虫ADH基因家族进化树的构建

使用MEGA 11.0将松材线虫ADH基因家族的蛋白序列与异交线虫Caenorhabditis nigoni、远交线虫Caenorhabditis remanei、布里格氏隐杆线虫Caenorhabditis briggsae、Pristionchus fissidentatus、水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi等其它线虫的ADH蛋白序列进行多序列比对，之后基于邻接法构建进化树，自检值设置为1 000次（Seung-Hae et al.，2014）。

1.3   松材线虫ADH基因家族的理化性质分析

Expasy平台（https://www.expasy.org/）提供了对蛋白质理化性质的分析工具，这些可以帮助研究人员了解蛋白质的基本物理和化学性质，这对于蛋白质的功能研究具有意义（梁文凯等，2024）。通过ProtParam对松材线虫ADH蛋白家族的氨基酸组成、分子量、等电点、和脂肪系数等信息进行整理（Martins et al.，2020）。

1.4   松材线虫ADH基因家族进化树构建和保守结构域分析

基于MEGA 11.0对12个松材线虫ADH蛋白序列进行多序列比对，构建最大似然树，自检值设置为1 000次（Diao et al.，2021；吴怡蓓等，2023）。根据MEME（http://meme-suite.org/）工具对松材线虫ADH蛋白的保守基序分布情况进行整理，将结果与最大似然树结合，绘制标有保守基序结构的基因结构图（武映宏等，2022）。

1.5   松材线虫ADH基因家族染色体分布与蛋白结构分析

本研究通过对松材线虫基因注释文件进行筛选获取到包括它们在染色体上的位置与距离、起始终止位点及基因长度等信息（谭瑞娜等，2023），利用这些获得ADH基因的注释信息，结合TBtools工具，即绘制出12个Bxadh基因在松材线虫染色体上的分布密度图（Cao et al.，2023）。为了满足进一步了解和分析松材线虫ADH家族蛋白的特性的需求，使用Prabi和Protter等在线工具对其二级结构进行分析（刘艳丽等，2019）。之后在Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）上对松材线虫ADH基因进行蛋白三级结构预测分析（Diao et al.，2021）。

1.6   松材线虫ADH基因家族蛋白在松材线虫不同虫态中的表达

为深入了解松材线虫ADH家族蛋白在生长发育过程中的具体作用，本研究结合松材线虫ADH基因家族在不同虫态的转录组数据（NCBI编号：PRJDB7519和PRJDB3458），获取了12个松材线虫ADH基因家族成员在不同虫态的表达值（FPKMs）（武映宏等，2022）。随后，利用OmicStudio Tools的Heatmap Plots工具（https://www.omicstudio.cn）对转录组中的ADH家族表达数据进行标准化处理，并绘制表达模式图（Duan et al.，2022）。

2.   结果与分析

2.1   松材线虫ADH基因家族的鉴定及理化性质

通过对松材线虫ADH基因家族进行Wormbase数据库BLASTX检索比对和保守结构域预测，获得12个ADH基因家族成员，将其命名为BxADH1 ~BxADH12（表 1）。

基因家族理化性质分析结果表明，BxADH蛋白氨基酸组成个数平均为381.25个，其中BxADH8的氨基酸数量最多，为453个氨基酸。分子量在37.63~49.44 kDa之间。等电点在5.86~9.12范围内。12个BxADHs中，BxADH2、BxADH3、BxADH4、BxADH7和BxADH8均为亲水蛋白，其余为疏水蛋白，除BxADH1为不稳定蛋白，其余均为稳定蛋白（表 2）。

2.2   松材线虫ADH基因家族进化树分析及与其他线虫ADH基因家族进化树的构建

使用MEGA 11.0软件将松材线虫ADH基因蛋白进行多序列比对，并与秀丽隐杆线虫、鼠圆线虫Strongyloides ratti等已知的ADH基因家族的蛋白序列进行多序列对比，使用最大似然法构建系统进化树（图 1）。

图  1  松材线虫ADH基因家族与其他线虫ADH基因家族蛋白进化树的构建

注：Bx，松材线虫；Ce，秀丽隐杆线虫；SRAE，鼠圆线虫。

Fig.  1  Construction of BxADH and other nematode protein evolutionary trees

Note: Bx, Bursaphelenchus xylophilus; Ce, Caenorhabditis elegans; SRAE, Strongyloides ratti.

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基因结构分析显示，松材线虫ADH家族外显子个数为3~7个。通过分析系统进化树的结果发现亲缘关系较近的基因在基因结构上具有相似性，如BxADH2、BxADH3、BxADH4皆有3个外显子（图 2）。

图  2  松材线虫ADH家族基因结构及保守基序分析

注：比例尺为松材线虫ADH基因长度（bp）。

Fig.  2  Structure and conserved motif of BxADHs in Bursaphelenchus xylophilus

Note: Scale bars represented the length of Bxadhs (bp).

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MEME共检索到12个BxADH共包含有8个Motif，将它们命名为Motif 1~Motif 8，相同Motif在不同成员上排列顺序基本一致。除BxADH1、BxADH9和BxADH10外，其余成员均含有Motif 1~Motif 8，所有成员均含有Motif 3。通过NCBI-CDD进一步分析发现除Motif 3外，Motif 1~Motif 8均为MDR超家族，Motif 3为AdhP超家族，Motif结果进一步证实它们均属于松材线虫ADH基因家族。

2.3   松材线虫ADH基因家族染色体分布与蛋白结构分析

据染色体分布情况表明，12条Bx-adhs基因位于松材线虫的4条染色体上（图 3）。其中Bxadh1位于1号染色体下部；Bxadh2位于2号染色体的中上部，Bxadh3、Bxadh4和Bxadh5位于2号染色体的中下部，Bxadh6、Bxadh7和Bxadh8位于2号染色体的下部；Bxadh9单独位于4号条染色体的下部，Bxadh10位于4号染色体的中部，Bxadh11和Bxadh12位于5号染色体的中下部。共有7个Bxadhs分布在3号染色体上，分布较为集中。通过Expasy提供的在线SOPMA程序对蛋白进行二级结构分析得出（表 3），12个ADH蛋白主要以α–螺旋、β–折叠、β–转角和无规则卷曲为主。拓扑异构分析发现，12个ADH蛋白均为胞内蛋白（图 4）。蛋白三级结构预测分析发现（图 5），BxADH2、BxADH3、BxADH4、BxADH5、BxADH6、BxADH7、BxADH9、BxADH12结构类似，具有口袋结构，可能参与异源物质的共轭，维持线虫体内稳态，这与王林松等人的研究类似（Wang et al.，2024）。

图  3  松材线虫ADH家族基因的染色体定位

注：比例尺为松材线虫染色体碱基数量（bp）。

Fig.  3  Chromosomal position of BxADHs in Bursaphelenchus xylophilus

Note: Scale bars represented the number of chromosome bases of B. xylophilus (bp).

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图  4  松材线虫ADH基因家族蛋白的拓朴结构分析

Fig.  4  Topological analysis of BxADHs in Bursaphelenchus xylophilus

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图  5  松材线虫ADH基因家族蛋白三维结构预测

Fig.  5  Three-dimensional structure of BxADHs in Bursaphelenchus xylophilus

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2.4   ADH基因在松材线虫不同虫态中的表达

经过计算RPKM值，获取了ADH基因家族成员在松材线虫不同虫态下的表达量，并利用TBtools绘制热图，可得到12个Bxadh基因在松材线虫不同虫体中的表达谱（图 6）。分析表达谱可知，Bxadh4在松材线虫的卵中表达尤为显著，推测其在卵发育过程中起到一定作用；Bxadh3和Bxadh7在3龄幼虫（L3）时期表达较显著，Bxadh2、Bxadh3、Bxadh7和Bxadh8在4龄幼虫（L4）时期表达较明显，推测他们可能与正常发育过程有关；Bxadh5在松材线虫雄虫的时期表达显著，说明它可能影响着松材线虫的性别分化，尤其影响着雄虫形成；在滞育态3龄幼虫（D3）时期，Bxadh6和Bxadh12的表达较为明显；Bxadh6、Bxadh10和Bxadh11在扩散态4龄幼虫（D4）时期中表达较显著。

图  6  ADH基因家族在松材线虫不同虫态虫卵中的表达

注：Egg，卵期；L2，2龄幼虫；L3，3龄幼虫；L4，4龄幼虫；D3，滞育态3龄幼虫；D4，扩散态4龄幼虫；Male，雄成虫；Female，雌成虫。

Fig.  6  Expression pattern of Bxadhs in different ages of Bursaphelenchus xylophilus

Note: Egg, Egg stage; L2, 2^nd instar larva; L3, 3^rd instar larva; L4, 4^th instar larva; D3, Diapause 3^rd instar larva; D4, Dispersal 4^th instar larva; Male, Male adult; Female, Female adult.

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3.   结论与讨论

松材线虫病是一种危害性很强的植物病害，其致病性与松材线虫的传播有着密切的关系。来自不同地区所分离的松材线虫对松树的破坏能力也各不相同，这可能是松材线虫体内的某些基因家族变异所致（Mota et al.，2006；Palomares-Rius et al.，2015）。基因家族是由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，各自具有不同的表达调控模式（Li et al.，2025）。王林松等人发现了一个来源于松材线虫的编码ADH的adh-1基因，通过对adh-1基因进行RNA干扰和福美吡唑试验的结果表明，adh-1参与了松材线虫对乙醇的耐受，并与松材线虫的繁殖有关，表明乙醇可能通过ADH参与调节松材线虫的增殖（Wang et al.，2019）。在随后的几年里，王林松等人选择松材线虫ADH基因家族作为福美吡唑选择性抑制剂的药物靶标，发现ADH基因家族的表达调控经过药物抑制对松材线虫的卵孵化率、发育、排卵和寿命有很大的负面影响，这表明ADH基因可能是控制PWN的潜在药物靶标（Wang et al.，2024）。张伟等人也发现松材线虫ADH基因家族在异生物解毒途径中为了适应新环境时，出现了基因扩增，促进了其在松树树脂管道中的生存，更好的解释了基因家族在进化过程中发挥着重要作用（Zhang et al.，2020）。

ADH基因同时也广泛存在于各种物种中，包括原核生物、真菌、植物和动物（Zhang et al.，2015）。同时ADH基因在种群生物学和进化遗传学原理发展过程中也起着重要的作用（Strommer et al.，2011）。有研究表明，ADH参与多种生物的异物代谢过程，为维持生物内环境稳定作出了重要的贡献（Wang et al.，2024）。ADH2在维持球孢白僵菌Beauveria bassiana和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae的分生孢子与昆虫角质层的黏附、毒力和昆虫致病中发挥重要作用（Zhou et al.，2021）。此外，ADH还参与介导了秀丽隐杆线虫的抗衰老反应，ADH在多株长寿秀丽隐杆线虫中上调表达，并且是长寿表型所必须的（Ghaddar et al.，2023）。ADH还参与了多种植物的各种胁迫耐受反应、脂质代谢和发育相关功能。ADH在植物中是一个小的基因家族，在植物抵抗涝害、冷害、干旱等胁迫环境中起着非常重要的作用。同时，在哺乳动物中，乙醇通过不同的氧化和非氧化酶系统代谢氧化途径主要负责乙醇的清除，流体控制分析表明在哺乳动物中依赖型乙醇脱氢酶（Zn-ADHs），即中链脱氢酶，是调节乙醇氧化速率的主要酶（Yao et al.，2010）。部分ADH基因在松材线虫卵期、4龄虫期表达明显上调。本研究推测部分Bx-adhs可能参与松材线虫的卵孵化、成虫分化和雄虫的发育。结合前人的研究基因家族的结果，可以更好地理解基因的进化历史和功能多样性。本研究将为松材线虫在宿主松树中的定殖和防控技术的开发与应用提供重要的理论资料。

本研究基于生物信息学方法，成功鉴定出了12个松材线虫ADH家族成员。对松材线虫ADH蛋白的理化性质分析后发现，基因编码的氨基酸数量差异不大，在350~453个之间，分子量在37.63~49.44 kDa之间，Bxadh2、Bxadh3、Bxadh4、Bxadh11和Bxadh12均含有3个外显子，Bxadh集中分布在松材线虫第三条染色体上。对松材线虫Motif分析发现，所有松材线虫ADH基因家族成员均含有Motif 3。通过分析ADH基因家族成员在松材线虫不同虫态虫卵中的表达量能够发现，ADH基因参与了松材线虫的卵孵化、幼虫发育和雄虫性别分化等过程，并起到了重要作用。分析松材线虫ADH基因家族的序列和蛋白结构等信息，可在预测和识别松材线虫ADH蛋白中发挥作用的方面，分析结果表明ADH基因家族在松材线虫的卵发育、正常发育及雄虫的形成环节中都起到了不可替代的作用，为研究ADH基因家族的生理生化功能建立基础。但乙醇脱氢酶在松材线虫中所起到的具体生物学功能还需要进一步的验证。