实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种在转录水平上对mRNA表达量进行定量的方法。因其具有定量准确、定量范围广、可重复、便于操作且所需样品起始量少等优点，已在基因表达的定量研究中获得广泛应用（Gao et al.，2023）。然而，在qRT-PCR中，需引入表达稳定的内参基因作为参照物对表达结果进行校正和标准化处理，以消除不同样本在RNA的产量和质量上可能存在的差别。同时，在不同的试验条件和不同组织中，能够稳定表达的内参基因不同。要得到准确、真实的定量结果，就需要筛选出在试验条件下表达最稳定的内参基因。根据Vandesompele（2002）的研究，仅使用一个参考基因可能导致高达20倍的误差，建议至少使用两个参考基因。此外，内参基因的表达在不同的细胞类型和试验系统中差异很大，许多“经典”内参基因不一定适用（Radonić et al.，2004）。因此，在利用qRT-PCR技术研究目的基因表达水平时，为了得到数据的矫正和标准化，需要依据不同的样本和试验处理条件选择相对合适且稳定的内参基因。

赤拟谷盗Tribolium castaneum是世界范围内广泛分布且具有重要经济意义的世界性储粮害虫，同时其作为重要的模式昆虫而被广为研究。目前已有对赤拟谷盗多方面的研究，但是关于其内参基因的稳定性研究尚不完全，想要更好地实现内参基因的校准化，就需要更加系统和全面地评估赤拟谷盗内参基因。Lord探究了赤拟谷盗在昆虫病原真菌白僵菌Beauveria bassiana侵染条件下，对不同内参基因进行了筛选（Lord et al.，2010）。Toutges（2010）探究了赤拟谷盗的不同发育阶段和不同组织中（较窄范围）的候选内参基因的稳定性。Sang（2015）对在不同发育阶段和不同的紫外线B（UVB）照射条件下的赤拟谷盗内参基因进行筛选。

赤拟谷盗作为自然界中重要的储粮害虫，长期暴露于微生物环境中，无时无刻受细菌病原体的入侵。而上述研究并没有探究赤拟谷盗在细菌侵染条件下内参基因表达的稳定性。因此本试验在综合选择ACTB、CAD、RpL13A、RpL32、RpS3、RpS6、RpS18和Syx1A共8个内参基因的基础上，通过喂食革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus侵染赤拟谷盗，计算候选内参基因的平均表达量和差异情况，并使用ΔCq、geNorm、NormFinder和Bestkeeper对细菌侵染诱导后的赤拟谷盗不同组织和不同侵染时间点的基因转录水平进行分析，筛选出合适的内参基因，为赤拟谷盗的基因表达和分子生物学研究提供参考依据。

1.   材料与方法

1.1   供试昆虫和细菌

本研究使用的赤拟谷盗由西南大学蒋红波教授实验室惠赠，品系为Georgia1（GA1）。将孵化的赤拟谷盗幼虫以含10%酵母提取物的面粉进行饲养，置于温度（25 ± 1）℃，相对湿度（60 ± 5）%，光周期12 L∶12 D的条件下生长。

试验所用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌由本实验室保存。将菌种接种至新鲜的LB液体培养基中，于200 rpm，37℃过夜培养复苏。第2天将上述细菌培养液以1 ∶ 100（v/v）的比例接种到新鲜的LB液体培养基中，于200 rpm，37℃培养至菌液OD₆₀₀约1.0。

1.2   细菌喂食侵染

以水∶菌液﹕面粉为8∶4∶3（v/v/m）的比例配备面粉—菌液混合液，将30 μL混合液滴加到96孔板板盖上制成一片面粉碟片，每片面粉碟片含大肠杆菌5.8×10⁶ CFU或金黄色葡萄球菌5.8×10⁵ CFU（Knorr et al.，2015）。以无菌水代替菌液的面粉碟片作为阴性对照组。随机选取120头10日龄赤拟谷盗幼虫，分成3组，分别进行含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无菌水的面粉碟片的喂食。将每头赤拟谷盗幼虫单独置于96孔板的每个孔中，每头赤拟谷盗喂食一片面料碟片，直至赤拟谷盗把面粉吃完。

1.3   RNA的提取和cDNA的合成

在喂食面粉碟片后的6 h、12 h、24 h时，对每个时间段每个试验组（无菌水对照组、大肠杆菌组、金黄色葡萄球菌组）进行赤拟谷盗幼虫的解剖，分别取头、肠、脂肪体和表皮4个组织。将解剖组织迅速置于无菌无酶的1.5 mL离心管中，加入100 μL的RNAiso Plus溶液，并于研磨机中进行组织研磨。按照RNAiso Plus（TaKaRa）试剂盒说明书提取总RNA，并通过NanoDrop One检测RNA的浓度和质量，置于-80℃冰箱保存。

参照PrimeScript RT Reagent Kit（TaKaRa）使用说明书操作，以Oligo（dT）18为引物，采用10 μL反应体系进行反转录。反应程序为37℃ 15 min、85℃保持5 s。后续以此cDNA作为模板进行qRT-PCR反应。

1.4   内参基因的选择与引物设计

查阅赤拟谷盗和其他昆虫候选内参基因的文献（Lord et al.，2010；Toutges et al.，2010；Sang et al.，2015；Pan et al.，2016；Liu et al.，2017；Wang et al.，2018），选取8个具有不同功能的内参基因，即β-肌动蛋白（ACTB）、E-钙粘蛋白（CAD）、核糖体蛋白S13a（RpL13A）、核糖体蛋白L32（RpL32）、核糖体蛋白S3（RpS3）、核糖体蛋白S6（RpS6）、核糖体蛋白S18（RpS18）和突触融合蛋白1（Syx1A）。其中RpL32和RpS6根据GenBank中赤拟谷盗相应基因的序列信息，使用NCBI进行引物设计。所有引物由生工（生物工程上海）股份有限公司合成，具体引物信息参见表 1。

1.5   qRT-PCR反应

采用Go Taq qPCR Master Mix试剂盒（Promega）进行qRT-PCR，以上述合成的cDNA为模板，以上述候选内参基因的引物进行qRT-PCR反应。反应体系为：10 μL的2 × Go Taq qPCR Master Mix，1 μL上游引物，1 μL下游引物，2 μL的cDNA，总反应体系为20 μL。反应程序为：95℃ 2 min、95℃ 15 s、57℃ 15 s，40个循环；添加溶解曲线，试验数据用Bio-Rad CFX Maestro软件实时记录。每5头幼虫为1个生物学重复，每个处理3个生物学重复，每个生物学重复3个技术重复。

1.6   内参基因的评价

本试验通过计算每个内参基因的平均定量循环数（Quantification cycle，Cq）和对应的标准差SD（Standard deviation）来确定8个候选内参基因的表达量高低和差异大小。本试验8个候选内参基因的稳定性由ΔCq、geNorm、NormFinder和BestKeeper共同确定。ΔCq法通过比较每个样本中“基因对”的相对表达来确定稳定的内参基因（Silver et al.，2006）。geNorm通过计算内参基因稳定性M（Expression stability measure，M）值进行筛选，M值越小内参基因稳定性越好，反之则稳定性越差；geNorm作者建议使用低于1.5阈值的M值来鉴定稳定表达的内参基因（Vandesompele et al.，2002）。NormFinder先计算出内参基因表达稳定值，再根据稳定值大小筛选最合适的内参基因（Andersen et al.，2004）。BestKeeper通过计算获得每个基因之间产生配对的相关系数，标准偏差和变异系数，通过比较各个值的大小，对稳定性进行排名（Pfaffl et al.，2004）。综合四者分析结果，共同确定最优的内参基因。

2.   结果与分析

2.1   内参基因的表达量

将试验处理后6 h、12 h和24 h 3个时间点的数据和头、肠、脂肪体和表皮等不同组织的数据综合分析。在对照组中，候选内参基因的Cq值范围较广，最小的为20.79，最高的为31.19，大部分基因的Cq值在27~31之间（图 1-A）。RpS3、RpL32和Syx1A的SD较小，表示其差异较低；其中RpS3的Cq值为20.79，表达量高于其他候选基因，Syx1A的Cq值为27.23，表达量较低。在大肠杆菌侵染的试验组中，候选内参基因的Cq值范围较广，最小的为21.40，最高的为31.96，大部分基因的Cq值在27~32之间（图 1-B）。RpL32、RpS3和Syx1A的SD较小，表示其差异较低；其中RpS3的Cq值为21.40，表达量高于其他候选基因，Syx1A的Cq值为28.96，表达量较低。在金黄色葡萄球菌侵染的试验组中，候选内参基因的Cq值范围较广，最小的为21.72，最高的为31.46，大部分基因的Cq值在29~32之间（图 1-C）。RpS3、RpL32和Syx1A的SD较小，表示其差异较低；其中RpS3的Cq值为21.72，表达量高于其他候选基因，Syx1A的Cq值为29.53，表达量较低。综合分析可知，RpS3、RpL32是相对表达量较高且差异较低的两个内参基因。

图  1  赤拟谷盗的候选内参基因在不同细菌喂食处理条件下的表达情况比较

注：A为对照组，赤拟谷盗喂食无菌水；B和C为试验组，分别对赤拟谷盗喂食大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。均取赤拟谷盗喂食处理后的6 h、12 h和24 h的头、肠、脂肪体和表皮等组织进行试验。图 2、图 3同。

Fig.  1  Comparison of the expression of candidate reference genes under different bacterial feeding conditions in Tribolium castaneum

Note: A was the control group. Tribolium castaneum was fed with sterile water. B and C were the experimental groups. T. castaneum was fed with Escherichia coli and Staphylococcus aureus respectively. The head, gut, fat body and epidermis tissues were collected at 6 h, 12 h and 24 h after the feeding treatment. Same with Fig.2 and Fig.3.

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2.2   内参基因的表达稳定性

2.2.1   ΔCq分析

将试验处理后的6 h、12 h和24 h 3个时间点的数据与头、肠、脂肪体和表皮四种组织的数据综合分析。根据ΔCq算法的结果，赤拟谷盗候选内参基因在对照组中，RpL32表达最稳定，RpS3和Syx1A的表达较稳定（图 2-A）。在大肠杆菌侵染下，ACTB是表达最稳定的内参基因，RpS3和RpL32表达较稳定（图 2-B）。在金黄色葡萄球菌侵染下，RpS3表达最稳定，RpL32和Syx1A具有相近的稳定值，ACTB的表达也较稳定（图 2-C）。综合分析可知，RpS3和RpL32是3种情况下表达最稳定的基因。其中RpL32在正常情况下表达最稳定，RpS3在金黄色葡萄球菌侵染下表达最稳定。值得注意的是Syx1A在金黄色葡萄球菌侵染下具有较高的稳定性，而在大肠杆菌侵染下表达最稳定的是ACTB。

图  2  使用ΔCq对赤拟谷盗候选内参基因在不同细菌喂食处理条件下的稳定性比较

Fig.  2  Comparison of the stability of candidate reference genes using ΔCq under different bacterial feeding conditions in Tribolium castaneum

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2.2.2   geNorm分析

将试验处理后的6 h、12 h和24 h 3个时间点的数据与头、肠、脂肪体和表皮等不同组织的数据综合分析。根据geNorm的计算结果，赤拟谷盗候选内参基因在对照组中，稳定性从高到低的综合时间排序为：RpL32 = Syx1A > RpS3 > RpS6 > ACTB > CAD > RpL13A > RpS18，且只有Syx1A、RpL32和RpS3的M值在1.5以下（图 3-A）。在大肠杆菌侵染条件下，稳定性从高到低的综合时间排序为：RpS3 = RpL32 > Syx1A > RpS6 > ACTB > CAD > RpL13A > RpS18，且只有RpS3和RpL32的平均M值在1.5以下（图 3-B）。在金黄色葡萄球菌侵染条件下，稳定性从高到低的综合时间排序为：RpS3 = RpL32 > Syx1A > ACTB > CAD > RpL13A > RpS18 > RpS6，同样也只有RpS3和RpL32的平均M值小于1.5（图 3-C）。综合分析可知，在正常情况下，RpL32和Syx1A是最稳定的内参基因，RpS3为较稳定的内参基因。在细菌侵染条件下，RpS3和RpL32为最稳定的内参基因，Syx1A为较稳定的内参基因。

图  3  使用geNorm对赤拟谷盗候选内参基因在不同细菌喂食处理条件下的稳定性比较

Fig.  3  Comparison of the stability of candidate reference genes using geNorm under different bacterial feeding conditions in Tribolium castaneum

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2.2.3   NormFinder分析

本研究将对照组、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌侵染后的头、肠、脂肪体和表皮等不同组织的数据混合，将处理后6 h、12 h和24 h 3个时间点的数据分开，通过NormFinder计算出这9组样品中的候选内参基因的稳定值（表 2）。在对照组中，6 h表达最稳定是基因是ACTB，12 h表达最稳定的基因是Syx1A，而24 h表达最稳定基因是RpS3，可见3个时间点的表达最稳定的基因不同，综合考虑操作误差和其他表达较稳定的基因，发现RpS3在不同时间下都有稳定的表达，ACTB和RpL32在6 h和12 h表达稳定，而24 h时相对不稳定。而Syx1A在12 h和24 h具有较高的稳定性。

在大肠杆菌侵染下，6 h最稳定的基因是RpS18，12 h表达最稳定的基因是RpS3和RpL32，24 h表达最稳定是基因是Syx1A。同样3个时间点的最稳定基因不一致，但可以看出ACTB在大肠杆菌侵染的6 h内表达稳定，RpS18能在大肠杆菌侵染12 h内稳定表达，而Syx1A和RpS6在细菌侵染的较长时间后，表达变得稳定。RpS13A、RpL32、RpS18和RpS3都是在12 h后表达变得不稳定。

在金黄色葡萄球菌侵染下，6 h和12 h表达最稳定是Syx1A，24 h时表达最稳定是RpS3。可见Syx1A在金黄色葡萄球菌侵染下，短时间内表达会更加稳定，而RpS3在金黄色葡萄球菌侵染的24 h内都具有较高的稳定性（表 2）。

综合以上结果，对于不同组织不同时间点，对照组中表达最稳定是RpS3，具有较高稳定性的是ACTB、Syx1A和RpL32。在不同细菌侵染条件下，RpS3是表达最稳定的内参基因，而Syx1A也具有较高的稳定性。

2.2.4   BestKeeper分析

将试验处理后的6 h、12 h和24 h 3个时间点的数据与头、肠、脂肪体和表皮四种组织的数据综合分析。通过BestKeeper计算不同处理下不同组织的候选内参基因的稳定值和排名（表 3）。在对照组中，RpS3、RpL32和Syx1A具有较高的稳定性并依次排名前三。在大肠杆菌侵染下，RpL32表达最稳定，排名第一；RpS3和Syx1A表达也很稳定，排名第二和第三。在金黄色葡萄球菌侵染下，RpS3表达最稳定，排名第一；RpL32和Syx1A分别排名第二和第三，也具有较高的稳定性。综合分析可知，RpS3、RpL32和Syx1A具有较高的稳定性。

3.   结论与讨论

选择合适的内参基因，需要根据不同的试验条件或不同类型的细胞或组织进行比较选择，筛选出具有特异性稳定表达的内参基因。近年来的研究结果发现，常用的内参基因存在不稳定性，在qRT-PCR之前有必要对其稳定性进行重新评估。同时有许多学者建议，选择两个或更多的内参基因作为内参以得到更可靠的结果（Schmid et al.，2003）。

赤拟谷盗是已经完成全基因组测序的模式生物，也是研究细菌胁迫及储粮害虫免疫抗性机理的良好材料。利用qRT-PCR技术研究赤拟谷盗细菌免疫抗性相关基因的表达水平，首先需要对赤拟谷盗的稳定内参进行筛选。在单个基因作为赤拟谷盗qPCR的内参基因试验中，一般使用RpS3（Mahroof et al.，2005；Zou et al.，2007）、RPS6（Arakane et al.，2009；Morris et al.，2009）、Polyubiquitin（Arakane et al.，2005）和RPS18（Knorr et al.，2009）。据报道，ACTB在哺乳动物中差异很大，但被确定为细菌侵染蜜蜂头部表达最稳定的基因之一（Scharlaken et al.，2008）。CAD被发现在赤拟谷盗幼虫的头部和肠道中稳定表达（Morris et al.，2009）。因此本试验选择核糖体蛋白RpS3、RpS6、RpL32、RpS18和RpL13A；考虑研究中存在分开头、肠、脂肪体和上皮组织这四种组织的RNA样本，所以选择ACTB、Syx1A和CAD进行分析。值得注意的是，Lord（2010）提供的RpS6引物扩增长度为474 bp，通过试验发现该引物实际扩增的峰图中没有单峰，说明该引物的特异性不高，为此通过NCBI和DNAstar重新设计RpS6，扩增长度为144 bp，扩增峰图具有单峰。

目前赤拟谷盗已有的内参基因筛选试验主要针对真菌侵染、UVB暴露和较窄范围的不同组织与发育阶段的条件（Lord et al.，2010；Toutges et al.，2010；Sang et al.，2015）。在赤拟谷盗相关的研究中，还未有针对细菌侵染条件下进行内参基因稳定性的筛选。本研究进行了基因表达量的分析，利用ΔCq、geNorm、NormFinder和Bestkeeper对8个候选内参基因在不同细菌侵染诱导后的6 h、12 h和24 h，对头、肠、脂肪体和表皮等四种组织的基因表达稳定性进行了综合分析。综合分析对照组和细菌侵染试验结果，在正常发育的赤拟谷盗的不同组织的混合样本中，RpS3在长时间（6~24 h）内均保持稳定，ACTB和RpL32在前中期（6~12 h）保持稳定，Syx1A在后期（24 h）保持稳定。面对细菌侵染时，RpS3和RpL32能够保持最高的稳定性，Syx1A也能保持较高的稳定性。ACTB在大肠杆菌侵染试验中，由ΔCq和geNorm两种算法得出的结论不一致，可能由于两种算法的侧重点不一致导致的。ΔCq通过比较基因的Cq值差异来计算相对表达量，关注的是基因表达的相对变化，而NormFinder是基于基因表达数据的稳定性来筛选内参基因，关注的是基因在不同样本或条件下的表达稳定性。通过参考RefFinder软件的综合分析（Xie et al.，2012；Xie et al.，2023），ACTB在大肠杆菌侵染下表达较稳定，这与Scharlaken等（2008）在细菌侵染蜜蜂头部的试验结果相符。同时也说明不同的算法得出的结论可能不同，这种现象在其他研究报道中也均有出现（Pan et al.，2016；Liu et al.，2017；Wang et al.，2018），因此需要进行综合比较。RpS18和RpL13A是不稳定的内参基因，可能在其它试验条件下是稳定内参基因。

Lord（2010）探究了白僵菌胁迫的条件下赤拟谷盗稳定表达的内参基因，发现最稳的是基因是RpS3、RpS18和RpL13A。Toutges（2010）探究了发育阶段和组织类型中内参基因的筛选，发现RpS3、RpS6、RpL13A和RpS18适用于组织和发育阶段综合的大规模基因表达分析，从发育阶段或组织类型来看（较窄范围），ACTB、Syx1A和CAD是稳定的基因。Sang（2015）探究了在UVB胁迫的条件下赤拟谷盗稳定表达的内参基因，发现RpS3、RpL13A和ACTB是稳定的内参基因。从以上3篇文章中可以得出，核糖体蛋白基因具有较广泛的稳定性。在真菌侵染试验、UVB试验和分组织与发育阶段的试验结果中，RpS3是最稳定内参基因（Lord et al.，2010；Toutges et al.，2010；Sang et al.，2015）。这与本试验细菌侵染的试验结果一致，RpS3同样是最稳定内参基因。不同的是，RpS18和RpL13A在上述条件中有较高的稳定性，而在细菌侵染条件下并不稳定。Syx1A在真菌侵染和UVB试验中表达不稳定，而赤拟谷盗所有生命阶段的qPCR中都是稳定的（Lord et al.，2010）；结果与本试验的相似，细菌侵染特别是金黄色葡萄球菌侵染条件下表达稳定。ACTB在UVB胁迫中表达稳定，同时也在不同发育阶段中较稳定；在本研究中，其在大肠杆菌侵染下表达也较稳定（Toutges et al.，2010；Sang et al.，2015）。说明不同的试验条件下，表达最稳定的内参基因不同。另外，结合Syx1A的表达量和稳定性可以得出，基因的表达稳定性与基因的表达丰度没有必然的联系。由于RpS6更换引物，所以无法与上述条件进行比较，在本试验条件下，RpS6表达不稳定。RpL32是本次试验新加入的候选基因，其稳定性也最为稳定，因此可能作为其它条件内参基因的参考。

综合以上分析，在细菌侵染试验中，RpS3和RpL32可以作为细菌侵染试验的内参基因，相对于其它内参基因的标准化结果更具可靠性。Syx1A也可以作为内参基因的候选，在金黄色葡萄球菌侵染条件下，可以作为最稳定的内参基因。在大肠杆菌侵染条件下，可以考虑ACTB作为内参基因。其中RpS3在前人研究白僵菌胁迫、不同发育阶段和组织类型、UVB胁迫条件下的最适内参基因一致（Lord et al.，2010；Toutges et al.，2010）。RpL32为本试验新选择并验证的内参基因，可能也适用于以上研究类似试验的后续参考。本试验的结果为昆虫免疫抗性和不同组织相关基因的表达分析提供了基础资料，同时也为其他昆虫的内参基因筛选提供了理论依据。