Establishment of embryonic cell lines of Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) and in vitro replication of Cydia pomonella granulovirus
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摘要:目的
昆虫细胞系是生物学、生理学和病毒学等研究领域的重要工具，苹果蠹蛾Cydia pomonella是一种具有毁灭性危害的入侵性害虫，目前国内尚未有苹果蠹蛾细胞系的报道。
方法本研究以苹果蠹蛾卵为材料建立胚胎细胞系，从中筛选对苹果蠹蛾颗粒体病毒（Cydia pomonella granulovirus, CpGV）敏感的细胞系，研究细胞系的核型和生长等生物学特性，通过实时荧光定量PCR（qPCR）和透射电子显微镜技术分析CpGV在细胞系中的离体复制。
结果本研究成功建立了8个苹果蠹蛾胚胎细胞系，可在含10%胎牛血清的TNM-FH培养基中稳定传代；筛选获得1个对CpGV敏感的细胞系QAU-Cp-E-11-L，QAU-Cp-E-11-L细胞为贴壁生长，圆形、梭形和棒状细胞的比例分别为90.0%、7.5%和2.5%；扩增的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因片段长度为576 bp，经Blast比对与苹果蠹蛾COI基因核苷酸序列的相似性为100%，证实该细胞系源自苹果蠹蛾；QAU-Cp-E-11-L细胞染色体数目为23~440条，染色体异倍化现象明显；QAU-Cp-E-11-L在培养168 h时细胞数量达到最大值2.27 × 106 cells/mL，群体倍增时间为33.81 h；CpGV接种QAU-Cp-E-11-L细胞，qPCR检测到CpGV在细胞内复制，12 d达到最高值2.48 × 108 copies/μg DNA，通过透射电子显微镜可以观察到CpGV包涵体在细胞内形成，随着感染时间的增加，细胞质内病毒包涵体数量增多。
结论本研究建立的苹果蠹蛾细胞系丰富了昆虫细胞系资源，可用于颗粒体病毒与宿主相互关系的深入研究。
Abstract:AimInsect cell lines serve as essential in vitro models for biological, physiological, and virological research. The codling moth, Cydia pomonella, is a highly destructive invasive pest; no cell lines of C. pomonella has been reported in China currently.
MethodsUsing eggs as starting material, embryonic cell lines of C. pomonella were established. From these, a cell line sensitive to Cydia pomonella granulovirus (CpGV) was screened, and its biological characteristics, including karyotype and growth were studied. The in vitroreplication of CpGV this cell line was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR) and transmission electron microscopy (TEM).
ResultsThe results showed that eight embryonic cell lines of C. pomonella were successfully established and could be stably passaged in TNM-FH medium containing 10% fetal bovine serum (FBS). One CpGV-sensitive cell line, designated QAU-Cp-E-11-L, was obtained. The cells grew adherently, the round, spindle-shaped, and rod-shaped cells accounted for 90.0%, 7.5%, and 2.5% of the total population, respectively. The amplified mitochondrial cytochrome oxidase Ⅰ subunit (COI) gene fragment was 576 bp in length. BLAST analysis revealed 100% nucleotide sequence identity with the COI gene of C. pomonella, confirming that the cell line derived from C. pomonella. The chromosome number of QAU-Cp-E-11-L cells varied from 23 ~ 440, indicating pronounced aneuploidy. The cell line QAU-Cp-E-11-L reached maximum density (2.27×106 cells/mL) at 168 h with a population doubling time of 33.81 h. Following infection of QAU-Cp-E-11-L cells with CpGV, qPCR detected CpGV replication in the infected cells, with the viral copy number reaching a maximum of 2.48×108 copies/μg DNA at 12 days post-infection (dpi). TEM observations results showed that the formation of CpGV occlusion bodies (OBs) in the cells, and the number of OBs in the cytoplasm increased with the inoculation time.
ConclusionHence, this study will enrich the resources of C. pomonella cell lines and provide critical tools for investigating granulovirus-host interactions.
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Keywords:
- Cydia pomonella /
- cell line /
- mitochondrial COI gene /
- granulovirus /
- in vitro replication
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苹果蠹蛾Cydia pomonella属于鳞翅目Lepidoptera、卷蛾科Tortricidae、小卷蛾亚科Olethreutinae，主要为害苹果、梨和核桃等（Reyes et al.，2007；Voudouris et al.，2011；Ju et al.，2021），在无虫害管理的果园中，苹果和梨的被害率可达80%和60%（Wan et al.，2019）。苹果蠹蛾严重危害全球果树产业安全（Tian et al.，2016），对于没有这一害虫的其他苹果和梨产区来说，仍是潜在性风险害虫。苹果蠹蛾于1953年首次在我国新疆被发现（张学祖，1957），目前已扩散到我国9个省市195个区县（陶少敏等，2025）。苹果蠹蛾颗粒体病毒（Cydia pomonella granulovirus，CpGV）对苹果蠹蛾特异性强、毒力高，CpGV已在欧美一些国家注册为防治苹果蠹蛾的杀虫剂产品，在害虫可持续防控中发挥了极其重要的作用（Moscardi，1999；Lacey et al.，2008；Lacey and Shapiro-Ilan, 2008）。
自高尚荫等成功建立家蚕Bombyx mori细胞系（Gaw et al.，1959）和Grace（1962）建立桉蚕蛾Anteraea eucalypti细胞系等可连续传代的昆虫细胞系以来，目前国内外已至少从170多种昆虫中建立了1 200个细胞系（Bairoch，2018；He et al.，2023）。随着昆虫细胞培养技术的发展，昆虫细胞系已经成为现代实验生物学的重要材料，广泛应用于生物学的各个领域（Granados et al.，2007；Smagghe et al.，2009），尤其是为昆虫病毒的侵染和复制、病原与宿主相互关系等基础研究，以及重组蛋白和病毒杀虫剂的生产等提供了理想的工具。杆状病毒是研究和应用最多的昆虫病毒，在害虫生物防治和生产疫苗等药物方面具有广阔的应用前景。不同的昆虫病毒具有不同的受纳离体细胞系统，核型多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus，NPV）比较容易在昆虫细胞系中复制，而颗粒体病毒（Granulovirus，GV）至今尚未建立起比较理想的离体复制系统，影响GV的深入研究。因此，建立和筛选能够支持GV离体复制的昆虫细胞系具有非常重要的意义。本文以苹果蠹蛾卵为材料，建立并筛选对CpGV敏感的细胞系，研究该细胞系的生物学特性和CpGV在其中的离体复制，为深入研究CpGV的分子生物学及其与宿主细胞的互作机制提供有价值的离体材料。
1. 材料与方法
1.1 胚胎细胞的原代和传代培养
苹果蠹蛾卵由中国农业科学院植物保护研究所张桂芬研究员提供，将约200粒新产的卵置于超净工作台中，参照Meng等（2008）和Zheng等（2021）的方法，用10%次氯酸钠溶液和75%乙醇依次消毒5 min，用无菌纯水冲洗，然后将卵粒转移至孔径为100 μm的无菌细胞筛中，加入5.0 mL含有15%胎牛血清（FBS）和100 μg/mL庆大霉素的TNM-FH培养基中研磨，吸取2.5 mL滤液移入25 cm2细胞培养瓶中，再加入2.5 mL上述培养基混匀，置于28℃培养箱中培养。每隔10~15 d更换1/2体积的培养基，待原代培养的细胞生长铺满细胞培养瓶底部后开始第一次传代培养，用移液管吹打细胞制成细胞悬浮液，各吸取2.5 mL细胞悬浮液和新鲜培养基加入细胞培养瓶中，在28℃培养箱中培养。待细胞再次生长铺满细胞培养瓶底部后，根据生长状态调整细胞的传代时间和比例。细胞在上述培养基中稳定传代10次后，将培养基中的FBS浓度降至10%继续培养，直至细胞生长稳定。在IX71倒置相差显微镜下观察原代和传代培养细胞的形态，拍照时使用绿色滤光片（500~600 nm），随机选取300个细胞用Image-Pro Plus 6.0软件测量其大小，并用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析。
1.2 细胞系线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因的鉴定
使用MagExtractor-Genome-试剂盒提取苹果蠹蛾卵和细胞系的基因组DNA，参照Folmer等（1994）方法对苹果蠹蛾卵和细胞系的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（Cytochrome oxidase Ⅰ subunit，COI）基因片段进行PCR扩增，将纯化的PCR产物送公司进行序列测定，在NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库中使用Blastn方法对COI基因片段核苷酸序列进行搜索比对分析。
1.3 细胞系染色体分析
取1瓶（25 cm2细胞培养瓶）对数生长期细胞，参照Zheng等（2021）的方法，培养基中加入秋水仙素至终浓度为1 μg/mL，处理15 h后收集细胞；依次用0.5% KCl溶液低渗处理10 min和Carnoy's固定液固定5 min；收集细胞后用固定液悬浮细胞，将细胞悬液滴于载玻片上，Gemisa染色后在显微镜下观察和拍照，用Excel软件对染色体数量和分布进行分析。
1.4 细胞生长曲线和群体倍增时间的测定
将浓度为2 × 105 cells/mL的对数生长期细胞接种到24孔细胞培养板中，每孔接种1 mL，在28℃条件下培养。每天随机选取3个孔的细胞，将细胞用细胞刮子刮下，用血球计数板计数细胞数量。分别以培养时间和细胞数量为X轴和Y轴，用Excel软件绘制细胞生长曲线，细胞群体倍增时间的测定方法参照Hayflick（1973）。
1.5 CpGV在细胞中的复制检测
1.5.1 CpGV芽生病毒粒子（BV）的制备
CpGV张掖株（CpGV-ZY）由西北农林科技大学王敦教授提供，将病毒颗粒体滴加于人工饲料表面，饲喂苹果蠹蛾4龄幼虫，4 d后将感病幼虫取出，在超净工作台内将幼虫用75%酒精消毒10 min，无菌纯水冲洗3次，用灭菌的滤纸吸干虫体表面的水分，用镊子夹住幼虫头尾，剪断腹足，将流出的血淋巴滴加于含有10%饱和苯基硫脲和1%庆大霉素的无血清TNM-FH培养基中，每头幼虫取1~2滴血淋巴，之后将含有血淋巴的培养基经0.45 μm滤膜过滤，制备好的CpGV BV于-80℃保存备用。
1.5.2 CpGV的实时荧光定量PCR（qPCR）检测
参照Zhang等（2023）方法，设计CpGV颗粒体蛋白基因引物Granulin F（CCCCGATTATGTTGCTCACG）和Granulin R（TGAGCGGGAACGCAAAGC），以CpGV基因组DNA为模板进行PCR扩增。将回收的PCR片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，构建qPCR标准质粒。首先将建立的8个苹果蠹蛾细胞系按3 × 105 cells/mL的浓度接种于12孔细胞培养板内，每孔1 mL，28℃过夜培养，以感染复数（MOI）为10的剂量接种CpGV BV，每孔加入100 μL的病毒悬液，对照加入100 μL的培养基，待吸附4 h后吸弃病毒悬液和培养基，每孔再加入1 mL的新鲜培养基，28℃条件下培养。分别在接种后的不同时间点取样，1 000 r/min离心3 min收集细胞，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞DNA，qPCR检测细胞中的病毒拷贝数，筛选对CpGV敏感细胞系。然后，将敏感细胞系QAU-Cp-E-11-L按上述方法接种CpGV BV，不同时间点取样，1 000 r/min离心3 min，分别得到细胞和培养液上清，提取细胞和培养液上清中的DNA，qPCR检测病毒含量，分析细胞和培养液上清中的病毒拷贝数变化。
1.5.3 CpGV侵染细胞透射电子显微镜观察
将浓度为2 × 105 cells/mL的QAU-Cp-E-11-L细胞接种到6孔细胞培养板，每孔接种2 mL细胞悬液，28℃条件下培养过夜。按上述方法用MOI为10剂量的CpGV BV感染细胞，每孔加入300 μL病毒悬液，分别在接种后的不同时间收集细胞悬液，离心收集细胞，将细胞沉淀先用2.5%戊二醛固定，用低熔点琼脂糖包埋细胞。参照Winstanley和Crook（1993）方法，对样品进行戊二醛和锇酸固定、脱水、包埋、切片和染色，在透射电子显微镜下观察和拍照。
2. 结果与分析
2.1 苹果蠹蛾胚胎细胞系的建立
原代培养的苹果蠹蛾胚胎细胞大部分可在2~5 d观察到细胞贴壁的现象，随后贴壁的细胞和组织逐渐增多，一些细胞和组织向外伸展形成网状结构（原代培养18 d的胚胎细胞，图 1-A）；原代培养20~40 d，其中可看到部分组织出现收缩蠕动现象，之后逐渐有新的细胞从网状组织结构中产生（图 1-B）；随着原代培养时间延长，新产生的细胞数量不断增加，可见部分区域细胞出现明显成堆生长现象。原代培养50~70 d，细胞分裂的速度加大，逐渐在细胞培养瓶的底部长满细胞（图 1-C）；部分原代培养最早可在90 d左右进行细胞的第1次传代，以后根据传代培养细胞的生长状态调整传代时间和比例，经过多次传代后细胞生长逐渐稳定，本研究从13个原代培养中共建立了8个苹果蠹蛾胚胎细胞系，目前均已传代培养超过70次。
图 1 苹果蠹蛾胚胎细胞的原代和传代培养注：A, 原代培养18 d的细胞；B, 原代培养30 d的细胞；C, 原代培养90 d的细胞；D, 传代培养的QAU-Cp-E-11-L细胞；Bar=100 μm.Fig. 1 Primary culture and subculture of Cydia pomonella embryonic cellsNote: A, Primary cells cultured for 18 d; B, Primary cells cultured for 30 d; C, Primary cells cultured for 90 d; D, QAU-Cp-E-L cells at subculture.
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2.2 对CpGV敏感细胞系的筛选
将CpGV BV分别接种8个对数生长期的苹果蠹蛾细胞系，qPCR测定结果表明，接种CpGV 4 d QAU-Cp-E-11-L细胞中的病毒拷贝数达到3.85 × 107 copies/μg DNA，在8个细胞系中最高（图 2），表现出对CpGV最为敏感，选择该细胞系进行后续研究。
图 2 CpGV感染不同苹果蠹蛾细胞系4 d的病毒拷贝数检测Fig. 2 CpGV replication levels in different Cydia pomonella cell lines at 4 days post-infection (dpi)下载:
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2.3 QAU-Cp-E-11-L细胞系形态和分子鉴定
QAU-Cp-E-11-L细胞在培养瓶中贴壁生长（图 1-D），细胞形态以圆形为主，占比为90.0%，细胞直径为（18.2 ± 4.3）μm；梭形细胞占比为7.5%，大小为（54.5 ± 10.9）×（16.2 ± 3.1）μm；棒状细胞占比为2.5%，大小为（36.2 ± 6.5）×（17.8 ± 2.9）μm。
扩增细胞系QAU-Cp-E-11-L的COI基因片段长度为576 bp，经Blast分析与苹果蠹蛾卵的COI基因片段（GenBank Accession: KR704271.1）的核苷酸相似性为100%，证实该细胞系源自苹果蠹蛾。
2.4 QAU-Cp-E-11-L细胞系染色体分析
QAU-Cp-E-11-L细胞系染色体形态如图 3-A，染色体多为颗粒状，少数为短杆状，染色体数目众多且变异较大。统计了148个中期分裂相的细胞染色体，其染色体数目变动范围为23~440条，染色体数目分布如图 3-B。其中细胞染色体数目最多的为151~200条，占总数的33.1%，其次为101~150条，占比30.4%，以下依次为51~100条、201~250条、1~50条、251~300条、301~350条、351~400条和401~450条，分别占13.5%、8.9%、6.8%、4.7%、1.4%、0.7%和0.7%。相比苹果蠹蛾虫体染色体2n = 56（Fuková et al.，2005；Wan et al.，2019），离体细胞中染色体异倍化现象明显，符合鳞翅目昆虫细胞系的染色体特征。
图 3 QAU-Cp-E-11-L细胞系染色体注：A, 染色体形态；B, 染色体数量分布。Fig. 3 Chromosomes of QAU-Cp-E-11-L cellsNote: A, Morphology of chromosomes; B, Chromosome number distribution.下载:
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2.5 QAU-Cp-E-11-L细胞生长曲线和群体倍增时间
QAU-Cp-E-11-L细胞的生长曲线见图 4，接种后的24 h细胞数量开始增加，至48 h细胞数量增加仍比较缓慢，之后细胞进入快速生长阶段，细胞数量增加明显，并在168 h时达到最大值2.27 × 106 cells/mL。细胞达到最大数量后，受营养和空间等因素的影响而进入衰退阶段，细胞聚集成团，细胞活力降低导致细胞数量明显下降。经计算，QAU-Cp-E-11-L细胞的群体倍增时间为33.81 h。
图 4 QAU-Cp-E-11-L细胞的生长曲线注：数据为平均值±标准差。Fig. 4 Growth curve of QAU-Cp-E-11-L cellsNote: The data were shown as mean ± standard deviation.下载:
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2.6 CpGV在细胞系QAU-Cp-E-11-L中的复制
将CpGV按感染复数（MOI）为10的剂量接种QAU-Cp-E-11-L细胞，不同时间分别提取细胞和培养液上清中的总DNA，qPCR检测CpGV的复制情况，结果表明，培养液上清中病毒拷贝数在4 d时达到最高值，为9.80 × 107 copies/mL，随后呈下降趋势（图 5-A）；胞内病毒拷贝数随感染时间延长呈递增趋势，在12 d达到最高值，达到2.48 × 108 copies/μg DNA（图 5-B）。
图 5 CpGV感染QAU-Cp-E-11-L细胞不同时间的复制情况注：A，培养液上清中的病毒拷贝数；B，细胞中的病毒拷贝数。数据为平均值±标准差，不同字母表示不同天数平均值在P < 0.05水平差异显著。Fig. 5 CpGV replication levels in QAU-Cp-E-11-L cells at various post-infection time pointsNote: A, Virus copies in the culture supernatant; B, Virus copies in the cells. The data were shown as mean ± standard deviation. Different lowercase letters above bars indicated significant differences mong days at P < 0.05.下载:
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在透射电子显微镜下观察CpGV在QAU-Cp-E-11-L细胞中的复制，CpGV感染后第2天可见细胞发生病变，在细胞质中能够观察到病毒粒子，而且在个别细胞的细胞质中发现少量的病毒包涵体（图 6-A）；CpGV感染后第4天，细胞体积膨大，细胞核内可见病毒发生基质（图 6-B），某些部位的细胞核膜发生严重扭曲（图 6-C）；CpGV感染后8 d，细胞器被破坏，细胞质内病毒包涵体数量明显增多（图 6-D），包涵体内的病毒粒子为单粒包埋（图 6-E）；在CpGV感染后期细胞发生严重病变，感染12 d后，细胞膜结构崩解，可观察到细胞核与细胞质发生融合（图 6-F）。
图 6 CpGV感染QAU-Cp-E-11-L细胞的透射电镜图注：A，细胞质内少量病毒粒子和包涵体出现（感染2 d）；B，病变细胞（左侧）体积膨大（感染4 d）；C，细胞核膜发生严重扭曲（感染4 d）；D，细胞质内病毒包涵体数量增多（感染8 d）；E，细胞质内的大量病毒包涵体（感染8 d）；F，细胞膜破碎，细胞核与细胞质融合（感染12 d）。V，病毒粒子；OB，包涵体；VS，病毒发生基质；NM，核膜；AO，不正常的细胞器。Fig. 6 Transmission electron micrograph of QAU-Cp-E-11-L cells infected with CpGVNote: A, A small number of virion and occlusion bodies appeared in the cytoplasm (at 2 days post-infection, dpi); B, The infected cells (left) was enlarged in size (at 4 dpi); C, Nuclear membrane undergoed severe distortion and deformation (at 4 dpi); D, The number of occlusion bodies in the cytoplasm increased. (at 8 dpi); E, A large number of occlusion bodies within the cytoplasm (at 8 dpi); F, The cell membrane broke down resulting in the mixing of the nuclear and cytoplasmic contents (at 12 dpi). V, Virion; OB, Occlusion bodies; VS, Virogenic stroma; NM, Nuclear membrane; AO, Abnomal organelles.下载:
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3. 结论与讨论
昆虫细胞系可用于病毒杀虫剂和疫苗等药物的生产，在病毒学和分子生物学等研究领域发挥着重要作用（Arunkarthick et al.，2017），Naser等（1984）报道了第一个支持CpGV离体复制的原代培养的苹果蠹蛾细胞系IZD-Cp-3300，Winstanley和Crook（1993）建立了苹果蠹蛾胚胎细胞系CpDWl，并从CpDWl中筛选出14个细胞系CpDW2-CpDWl5。而在国内尚未有苹果蠹蛾细胞系的报道，该细胞系的建立将为苹果蠹蛾的生理学和分子生物学研究提供了快捷和简便的离体材料。
昆虫杆状病毒在害虫生物防治中发挥着重要作用，杆状病毒科（Baculoviridae）中核型多角体病毒（NPV）的离体复制系统已经建立了50余年（Goodwin et al.，1970），而颗粒体病毒（GV）的离体复制一直都是一个难题，相关的报道也十分有限。已报道的几个能够复制颗粒体病毒的昆虫细胞系均来源于胚胎（Granados et al.，1986；Winstanley and Crook, 1993；Lery et al.，1997），这可能是由于胚胎组织分化程度较低，易于接受GV侵染并完成复制。本研究所建的8株苹果蠹蛾胚胎细胞系对CpGV的敏感性不同，这与之前报道的源自同一组织的不同细胞系对病毒的敏感性表现不同结果相一致（Zhang et al.，2014；Su et al.，2016）。不同细胞系中的细胞种类、细胞形态和生物学特性不同会导致对病毒敏感性的差异，同时，细胞对病毒抗性机制还涉及病毒进入、病毒复制、病毒基因转录以及宿主免疫信号通路的调控等多个环节（Zhang et al.，2014；Li et al.，2023），病毒敏感性差异机制是昆虫与病毒关系理论和应用中非常关键的问题，值得更多的关注和探究。Winstanley和Crook（1993）在21℃低温条件下建立的苹果蠹蛾胚胎细胞系能够完成GV的离体复制，而相同细胞系维持在27℃条件下则逐渐失去了对病毒的敏感性，最终根本不能被CpGV感染，这可能与低温条件下细胞生长缓慢，能够与GV复制的速度一致有关。本研究所建细胞系同样源自苹果蠹蛾胚胎组织，目前QAU-Cp-E-11-L细胞已在28℃条件下传代100余次，仍可以被CpGV感染，在CpGV感染细胞的第2天就观察到有少量病毒包涵体产生，细胞中的病毒产量在接种后12 d可以达到2.48 × 108 copies/μg DNA，而Winstanley和Crook（1993）筛选的对CpGV敏感的细胞系CPDW14，其病毒滴度最高只有3.5 × 106 TCID50/mL，在CpGV感染CpDWl4细胞后4 d可以观察到感染的早期迹象，6 d细胞内产生大量的包涵体，说明本研究建立的QAU-Cp-E-11-L细胞系支持CpGV复制组装的速度较快和对CpGV的敏感性更强。
本研究采用的是qPCR方法对GV进行量化，测定病毒滴度的传统方法是终点稀释法，通过在显微镜下观察细胞的感染率来计算，暗场显微镜是目前应用最多的杆状病毒量化技术（Eberle et al.，2012），由于GV包涵体大小为0.15~0.5 μm，在光学显微镜的分辨率极限内计数比较困难，从而影响了GV计数的准确性和重复性。基于qPCR的GV量化方法，可以提高GV绝对定量的重复性和准确性（Dhladhla et al.，2018；Zhang et al.，2023）。
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图 1 苹果蠹蛾胚胎细胞的原代和传代培养
注：A, 原代培养18 d的细胞；B, 原代培养30 d的细胞；C, 原代培养90 d的细胞；D, 传代培养的QAU-Cp-E-11-L细胞；Bar=100 μm.
Fig. 1 Primary culture and subculture of Cydia pomonella embryonic cells
Note: A, Primary cells cultured for 18 d; B, Primary cells cultured for 30 d; C, Primary cells cultured for 90 d; D, QAU-Cp-E-L cells at subculture.
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图 2 CpGV感染不同苹果蠹蛾细胞系4 d的病毒拷贝数检测
Fig. 2 CpGV replication levels in different Cydia pomonella cell lines at 4 days post-infection (dpi)
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图 3 QAU-Cp-E-11-L细胞系染色体
注：A, 染色体形态；B, 染色体数量分布。
Fig. 3 Chromosomes of QAU-Cp-E-11-L cells
Note: A, Morphology of chromosomes; B, Chromosome number distribution.
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图 4 QAU-Cp-E-11-L细胞的生长曲线
注：数据为平均值±标准差。
Fig. 4 Growth curve of QAU-Cp-E-11-L cells
Note: The data were shown as mean ± standard deviation.
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图 5 CpGV感染QAU-Cp-E-11-L细胞不同时间的复制情况
注：A，培养液上清中的病毒拷贝数；B，细胞中的病毒拷贝数。数据为平均值±标准差，不同字母表示不同天数平均值在P < 0.05水平差异显著。
Fig. 5 CpGV replication levels in QAU-Cp-E-11-L cells at various post-infection time points
Note: A, Virus copies in the culture supernatant; B, Virus copies in the cells. The data were shown as mean ± standard deviation. Different lowercase letters above bars indicated significant differences mong days at P < 0.05.
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图 6 CpGV感染QAU-Cp-E-11-L细胞的透射电镜图
注：A，细胞质内少量病毒粒子和包涵体出现（感染2 d）；B，病变细胞（左侧）体积膨大（感染4 d）；C，细胞核膜发生严重扭曲（感染4 d）；D，细胞质内病毒包涵体数量增多（感染8 d）；E，细胞质内的大量病毒包涵体（感染8 d）；F，细胞膜破碎，细胞核与细胞质融合（感染12 d）。V，病毒粒子；OB，包涵体；VS，病毒发生基质；NM，核膜；AO，不正常的细胞器。
Fig. 6 Transmission electron micrograph of QAU-Cp-E-11-L cells infected with CpGV
Note: A, A small number of virion and occlusion bodies appeared in the cytoplasm (at 2 days post-infection, dpi); B, The infected cells (left) was enlarged in size (at 4 dpi); C, Nuclear membrane undergoed severe distortion and deformation (at 4 dpi); D, The number of occlusion bodies in the cytoplasm increased. (at 8 dpi); E, A large number of occlusion bodies within the cytoplasm (at 8 dpi); F, The cell membrane broke down resulting in the mixing of the nuclear and cytoplasmic contents (at 12 dpi). V, Virion; OB, Occlusion bodies; VS, Virogenic stroma; NM, Nuclear membrane; AO, Abnomal organelles.
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