Study on the pathogenicity differences of two geographic populations of pine wood nematodes from North and South China on three larch species in Northeast China
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摘要:目的
松材线虫持续北扩西进，严重威胁中国东北地区松林资源，明确松材线虫对东北常见落叶松树种的致病性，对有效阻止松材线虫北扩具有重要意义。
方法采用人工接种的方法，将采自辽宁抚顺和湖南常德的松材线虫株系分别接种在3年生华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松实生苗上，分析松材线虫对3种落叶松的致病性和3种落叶松含水量、针叶叶绿素含量及防御酶活性等相关生理指标的变化。
结果接种常德虫株的华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松在第30天，发病率分别为100%、100%和86.7%，病情指数分别为90、85和82.1；针叶含水量分别为11.46%、35.35%和15.21%；松茎含水量分别为14.26%、16.13%和15.82%。接种抚顺虫株的华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松在第30天发病率均为100%，病情指数分别为100、100和96.4；针叶含水量分别为13.96%、9.53%和9.25%；松茎含水量分别为11.53%、12.2%和17.53%。抚顺虫株针对这三种落叶松具有较高的致病性。两个种群松材线虫对3种落叶松针叶叶绿素的影响结果相近，其中华北落叶松在接种后第30天的叶绿素含量最低。此外，接种早期APX、CAT、PAL、POD和SOD等防御酶活性在3种落叶松均出现明显变化且存在差异，其中接种抚顺松材线虫虫株后，3种落叶松的防御酶活性变化幅度差异较大。
结论通过将两个地理种群松材线虫接种到3种落叶松上，发现来自抚顺的松材线虫虫株相较常德虫株具有较强的致病性，其中日本落叶松发病时间较晚，华北落叶松更易被松材线虫侵染。
Abstract:AimThe continuous expansion of Bursaphelenchus xylophilus (pine wood nematode) to the north and west poses a serious threat to the pine forest resources in Northeast China. Clarifying the pathogenicity of B. xylophilus to common larch tree species in this region is of great significance in effectively preventing the northward expansion of B. xylophilus.
MethodsUsing manual inoculation, B. xylophilus strains collected from Fushun (Liaoning Province) and Changde (Hunan Province), were inoculated onto 3-year-old seedlings of Larix principis-rupprechtii, L. olgensis, and L. kaempferi. The pathogenicity of B. xylophilus to three types of larch along with the changes in physiological indicators such as water content, needle chlorophyll content, and defense enzyme activity were analyzed.
ResultsOn the 30th day, the incidence rate of L. principis-rupprechtii, L. olgensis and L. kaempferi inoculated with Changde strain were 100%, 100% and 86.7% respectively, and the disease index was 90, 85 and 82.1 respectively. The water contents of needle leaves were 11.46%, 35.35%, and 15.21%, respectively. The water contents of pine stems were 14.26%, 16.13%, and 15.82%, respectively. For the Fushun strain, the incidence rate of L. principis-rupprechtii, L. olgensis and L. kaempferi on the 30th day was all 100%, and the disease indeces were 100, 100 and 96.4 respectively. The water contents of needle leaves were 13.96%, 9.53%, and 9.25%, respectively. The water contents of pine stems were 11.53%, 12.2%, and 17.53%, respectively. The Fushun insect strain exhibited higher pathogenicity against these three types of larch. The effects of two populations of B. xylophilus on the chlorophyll content of three types of larch needles were similar, with L. principis-rupprechtii having the lowest chlorophyll content on the 30th day after inoculation. In addition, defense enzyme activities such as APX, CAT, PAL, POD, and SOD showed significant changes and differences in the early stages of inoculation among the three types of larch, with greater fluctuations observed in response to the Fushun strain.
ConclusionBy inoculating two geographical populations of B. xylophilus onto three types of larch, it was found that the B. xylophilus strain from Fushun demonstrated stronger pathogenicity compared to the Changde strain. Among them, the L. kaempferi had a later onset of disease, while the L. principis-rupprechtii was more susceptible to B. xylophilus infection.
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中国东北地区松树资源丰富，常见的有白皮松Pinus bungeana Zucc. ex Endl.、油松P. tabuliformis Carrière、红松P. koraiensis Siebold & Zucc.、樟子松P. sylvestris var. mongholica Litv.、云杉Picea asperata Mast.、落叶松Larix spp.等，对于维护生态平衡、保持水土、改善环境等方面起着至关重要的作用（Fang et al.，2022）。其中，因落叶松具有较强的耐寒性而广泛分布在东北地区（Li, Sun et al.，2022）。包括华北落叶松L. principis-rupprechtii、东北落叶松L. gmelinii、长白落叶松L. olgensis和西伯利亚落叶松L. sibirica等。
松材线虫病Pine Wilt Disease即松树萎蔫病，是一种以松材线虫为病原，墨天牛属昆虫Monochamus spp.为主要媒介（宋玉双和臧秀强，1989），综合人为参与、寄主松树、相关伴生菌和环境因素互作的复杂病害系统（理永霞和张星耀，2018；Xu et al.，2023；张秀芸等，2024）。松材线虫病以其病原潜伏时间长、发病迅速、治理难度大等特点，成为了松林面临的严重挑战之一（李敏等，2022；叶建仁和吴小芹，2022）。自1982年我国首次在南京中山陵发现以来，松材线虫病快速向北向西扩散，不仅突破了年均温10℃的界限，还出现了新的寄主和媒介昆虫，最北已到达吉林通化，最西已到达甘肃陇南严重威胁全国9亿亩松林资源（叶建仁和吴小芹，2022）。目前在中国发现的自然感病树种有黑松、赤松P. densiflora、马尾松P. massoniana、白皮松P. bungeana、黄山松P.taiwanensis、思茅松P. kesiya、湿地松P. elliottii、油松、长白落叶松、日本落叶松L. kaempferi和华北落叶松等（王曦茁等，2018；叶建仁和吴小芹，2022）。方天雨等（2022）在接种试验中发现无菌松材线虫能够导致4月龄华北落叶松无菌苗萎蔫；曹业凡等（2020）将辽宁、重庆与南京3个地理种群的松材线虫接种至2年生长白落叶松上，结果发现来自辽宁的松材线虫种群具备更高致病力；王建国等（2023）在3年生日本落叶松上接种来自辽宁新宾的松材线虫发现在第40天时日本落叶松全部枯萎死亡。这3种落叶松均存在自然感病的报道也有研究证实松材线虫对这3种落叶松存在致病性，但对于南北不同种源松材线虫对于3种落叶松的致病力差异研究较少。
已有研究发现，中国不同地区的松材线虫种群存在明显的遗传差异（Nickle WAR et al.，1981；贲爱玲等，2012）。孔青青将我国南方多地与辽宁的松材线虫接种至黑松及油松上进行比较，发现南北不同地理来源的松材线虫致病力存在明显差异（孔青青，2021）。但针对南北不同地理来源的松材线虫对东北地区常见落叶松致病性的研究较少。本研究通过人工接种南北不同种群的松材线虫，研究二者对3种落叶松的致病性及侵染早期落叶松防御酶活性变化，为东北地区松材线虫病防治提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
FS虫株，采自辽宁省抚顺市的感病红松；CD虫株，采自湖南省常德市的感病油松。选取生长状况、遗传背景一致的3年生华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松实生苗。两个种群的松材线虫处理组和对照组，分别50株。幼苗统一经人工栽种于尺寸为14.5 cm × 19 cm × 18 cm的花盆。
1.2 松材线虫对落叶松的致病性测定
参考贲爱玲等（2012）以皮接法进行松材线虫接种试验，使用解剖刀横切松苗茎段至木质部，从伤口中心向下纵切，切割伤口位置呈现“T”字型。伤口宽度约为0.3 cm，长度约为0.5 cm，确保切口深度到达木质部。将200 μL枪头插入伤口，使用封口膜包裹枪头下半部分和伤口并固定枪头位置，确保不出现漏液现象，接种线虫量为10 000头/株。以无菌水接种作为对照组。接种完成的松苗挂上写好编号的标签，记录树苗具体树种、接种时间、接种松材线虫株系和接种编号，每种落叶松每组处理各10株。
接种后第30天，将接种松材线虫的松苗从花盆中拔出，去除接种装置，从接种点以上将松树茎段截取成10 cm长的部分，利用贝尔曼漏斗法收集茎段中的松材线虫，并统计每部分茎段的线虫数，计算松材线虫的数量。同时，统计3种落叶松的发病情况和病情指数。落叶松的发病症状可以分为0~4级：0级代表落叶松所有针叶均为绿色；1级代表落叶松小于25%的针叶变为黄色；2级代表落叶松25%~50%的针叶变为黄色；3级代表落叶松小于50%~75%的针叶变为黄色；4级代表落叶松大于75%的针叶变为黄色。
$$ \begin{gathered} \text { 发病率 }(\%)=\frac{\sum \text { 发病落叶松数量 }}{\text { 接种落叶松总数 }} \times 100 \\ \text { 病情指数 }(D S I)=\frac{\sum \text { 各级发病落叶松数量 } \times \text { 各级代表值 }}{\text { 接种落叶松总数 } \times \text { 最高级代表值 }} \times 100 \end{gathered} $$ 1.3 落叶松针叶及松茎含水量测定
在接种后第1、3、7、15、21、30天进行采样和测定，线虫处理组和对照组分别采样5株。测定接种松材线虫后寄主的针叶和松茎的含水量指标的变化。从松苗冠层（顶部）到下部混合采样，分为3份针叶和茎段样品，采集后立刻使用万分位电子天平称量针叶样品准确重量，每份样品称取3次，得出鲜重（W1，g）。将针叶保存至纸质信封并标注样品名称、采样时间。样品采集完成后将样品放至烘箱，通过100℃杀青10 min后，将烘箱温度稳定在80℃，使样品完全烘干至恒重，取出样品分别称量，得到干重（W2，g）
$$ \text { 含水量 }(\%)=(\mathrm{W} 1-\mathrm{W} 2) / \mathrm{W} 1 \times 100 $$ 1.4 落叶松针叶叶绿素含量测定
在接种后第1、3、7、15、21、30天进行采样和测定，线虫处理组和对照组分别采样5株。使用美国OPTI-SCIENCES CCM-300叶绿素含量测量仪对针叶的叶绿素进行测定。每组处理每棵松苗由上至下选择不同3处位置的针叶，将针叶平铺，完全覆盖仪器孔径，每处位置测量3次获得叶绿素数据。
1.5 落叶松针叶防御酶活性测定
在接种后第1、3、7天进行采样和测定，线虫处理组和对照组分别采样5株。落叶松针叶的抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的测定均使用上海美吉生物医药科技有限公司的ELISA检测试剂盒，具体使用和操作方法见试剂盒。
1.6 数据统计分析
利用SPSS 25软件对落叶松针叶含水量、松茎含水量、针叶叶绿素及针叶防御酶活性的数据进行分析，采用独立样本t检验和单因素方差分析，以确定样本之间的差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 松材线虫对三种落叶松的致病性
3种落叶松接种松材线虫后症状呈现出感病初期针叶变软、枝条下垂，出现失水萎蔫的症状；第二阶段整株萎蔫、针叶颜色由绿变浅逐渐转为黄色；第三阶段松苗失水萎蔫症状加重，同时部分针叶出现脱落现象，当年生嫩枝发生褐变；第四阶段松苗全株枯萎，当年生嫩枝嫩叶颜色变红，针叶脱落现象明显加重（详见网络版增强出版材料附图 1~附图 3）。接种后第30天，接种CD虫株的华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松的发病率分别为100%、100%和85.7%，病情指数分别为90、85和82.1。接种FS虫株的华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松的发病率均为100%，病情指数分别为100、100和96.4（表 1）。根据发病率、病情指数来看，FS对3种落叶松具有更高的致病力。
表 1 落叶松接种后30天内发病率、病情指数及分离松材线虫数量Table 1 Incidence rate, disease index and number of Bursaphelenchus xylophilus recovered from Larix spp. at 30 days post-inoculation寄主类型
Host species松材线虫种类
B. xylophilus strain首次发病时间（d）
First symptom onset (days)接种15 d 15 d post-inoculation 接种30 d 30 d post-inoculation 发病率（%）
Incidence rate病情指数
Disease index分离松材线虫数量（条）
Number of B. xylophilus recovered发病率（%）
Incidence rate病情指数
Disease index分离松材线虫数量（条）
Number of B. xylophilus recovered华北落叶松
Larix principis-rupprechtiiCD 7 33.3 25.0 1570 ± 143 a 100.0 90.0 4 950 ± 387 a FS 5 33.3 33.3 780 ± 86 b 100.0 100.0 2 520 ± 248 b 长白落叶松
Larix olgensisCD 12 33.3 8.3 450 ± 57 a 100.0 85.0 1 100 ± 97 a FS 9 33.3 33.3 440 ± 101 a 100.0 100.0 1 530 ± 329 a 日本落叶松
Larix kaempferiCD 11 33.3 33.3 520 ± 93 b 85.7 82.1 1 155 ± 374 b FS 13 66.7 16.7 800 ± 132 a 100.0 96.4 2 600 ± 225 a 注：数值表示平均值±标准误，不同字母表示差异显著，t检验（P＜0.01）。Note: Values represented mean ± SE, and different letters within a row indicated significantly different according to t test, P < 0.01. 2.2 落叶松针叶及松茎含水量变化
3种落叶松针叶含水量均呈现逐渐下降的变化趋势（图 1）。接种后第30天时，接种CD虫株的华北落叶松、长白落叶松及日本落叶松针叶含水量平均值分别为11.46%、35.35%和15.21%，接种FS虫株的分别为13.98%、9.53%和9.25%。此外，3种落叶松松茎含水量变化趋势与针叶一致（图 2）。两个松材线虫种群对3种落叶松的水分含量均构成影响，其表现在松茎含水量相差较小，而针叶含水量存在一定差异，来自辽宁抚顺的松材线虫虫株对3种落叶松针叶的水分含量影响更大。
图 1 落叶松针叶含水量变化注：CD，接种CD虫株；FS，接种FS虫株；CK，对照组，接种无菌水。同组不同字母表示差异显著（P < 0.05）。下同。Fig. 1 Changes in water content of Larix spp. needlesNote: CD, inoculated with the CD strain; FS, inoculated with the FS strain; CK, Control group, inoculated with sterile water. Different letters in the same group indicated significant differences (P < 0.05). Same below.
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图 2 落叶松松茎含水量变化Fig. 2 Changes in water content of Larix spp. stems下载:
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2.3 落叶松叶绿素含量变化
在第15天，接种CD虫株的华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松针叶叶绿素含量均值分别是376.7、310.2和354 mg/m2；在第30天，接种CD虫株的华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松针叶叶绿素含量均值分别为224.3、378.2和342.1 mg/m2。在第15天，接种FS虫株的3种落叶松针叶叶绿素含量均值分别为422.3、344和340.1 mg/m2。在第30天，接种FS虫株的3种落叶松针叶叶绿素含量均值分别为239.9、399.3和326.8 mg/m2。两个种群松材线虫均能导致叶绿素含量下降，但影响差别较小（图 3）。
图 3 落叶松叶绿素含量变化Fig. 3 Changes in chlorophyll content of Larix spp.下载:
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2.4 侵染早期落叶松防御酶活性变化
华北落叶松线虫处理组接种7 d内，APX活性均上涨（图 4），接种FS虫株的APX活性涨幅达到96.4%，高于CD处理组。两组的CAT活性都呈现下降趋势，FS处理组的CAT活性始终高于CD处理组。CD处理组PAL活性呈下降趋势，FS处理组PAL活性先上升后小幅度下降，第7天，FS处理组PAL活性高于CD处理组。两组的POD活性均呈现先下降后上升的趋势，FS处理组高于CD处理组。而CD处理组的SOD活性变化不大，FS处理组的SOD活性在短暂上升后快速下降，降幅达到26.9%，活性值最低。
图 4 侵染早期落叶松防御酶活性变化Fig. 4 Changes in defense enzyme activity of Larix spp. during early infection下载:
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长白落叶松FS处理组的APX活性变化与对照组相似，先上升后下降，CD处理组APX活性缓慢上升（图 4）。CD处理组的CAT活性变化与对照组相似，先上升后下降，FS处理组的CAT活性在小幅度下降后快速上升，涨幅达到51.3%。CD处理组POD活性在小幅下降后快速上升，FS处理组POD活性由25.7 U/g降至16.4 U/g。两组的SOD活性均低于对照组且变化幅度很小。
日本落叶松在接种7 d内，FS处理组APX活性下降后上升，CD处理组呈随时间上升趋势，FS处理组APX活性始终高于CD处理组（图 4）。CD处理组的CAT活性在小幅上升后快速下降，FS处理组的CAT活性在接种后第3天下降至327.3 U/g后涨至618.5 U/g，涨幅约为89%。两个处理组的PAL活性都呈现先下降后上升的趋势，CD处理组各阶段变幅为23.2%和63.2%，FS处理组分别为63.6%和152.1%，FS处理组变幅高于CD处理组。两组的POD活性变化走势相似，均大幅上升后下降，CD处理组变幅分别为31.1%和5.1%，FS处理组变幅分别为69%和18.4%。FS处理组的SOD活性始终高于CD处理组，且变幅较大。
3. 结论与讨论
曾有学者指出松材线虫的适生区的年均温度应该在10℃以上(于海英等，2019)，但根据国家林业和草原局公告（2024年第4号）可知，我国松材线虫病疫区分布在我国18个省份，吉林省已有两个松材线虫病疫区。据徐钦望（Xu et al.，2023）等报道，在我国已经在我国东北、西北地区有明显的蔓延趋势。然而在我国东北地区，落叶松属于主要造林树种，人工栽培的主要有长白落叶松、兴安落叶松、日本落叶松和华北落叶松等（张秀芸等，2024），且华北落叶松、长白落叶松和日本落叶松均已在中国国内发现有自然感病的现象(于海英等，2019)。而南北不同地理种源的松材线虫对对东北地区常见落叶松的致病性差异有待进一步研究。
在本研究中，从发病率与病情指数来看，FS虫株比CD虫株致病力更高，而其中日本落叶松病情指数较低。从针叶、松茎两部分落叶松树体组织的含水量变化来看，所有松树的针叶、松茎的含水量均出现了显著的下降趋势。该变化与吕书等（2021）在湿地松上接种松材线虫后，湿地松针叶水分含量的变化相似。松材线虫对松树产生的胁迫作用，破坏树体内水分平衡，进而影响松树水分含量。综合针叶和松茎的含水量变化结果，来自辽宁抚顺的松材线虫（FS虫株）比来自湖南常德的松材线虫（CD虫株）更能造成寄主松树的水分含量降低。南北不同地理种源松材线虫表现出不同的致病力差异，可能是由于两个地理种群的遗传学差异导致致病力的差异；或是由于两个地理种群分离自不同的松树，这可能与松材线虫与寄主植物的适应性进化相关。
植物叶片中叶绿素主要承担吸收光能并将其转化为化学能的责任，从而推动光合作用的高效进行（梁芳等，2010）。据报道，当植物遭受干旱引起的水分胁迫时，其叶片的最大光化学效率往往会遭受显著下降（Ahmed et al.，2002），叶绿素荧光参数也会因此产生变化（李泽等，2017）。当树体含水量下降时，叶绿体膜系统会遭受紊乱，甚至整个叶绿体结构都会遭受破坏，进而干扰光合色素的正常合成过程（孙小玲等，2010；张明艳等，2017）。本试验中叶绿素含量的测定结果与前人研究相符，两个种群松材线虫对三种落叶松针叶的叶绿素含量影响较为相近，其中华北落叶松的叶绿素含量下降幅度最大，表明其更易受松材线虫侵染影响。水分含量的变化、针叶叶绿素变化与落叶松发病情况相符合，落叶松感病初期水分含量降低，树体表症出现针叶变软，枝条下垂，出现失水萎蔫症状；第二阶段落叶松整株萎蔫、针叶颜色由绿逐渐转为黄色；第三阶段落叶松失水萎蔫症状加重，同时部分针叶出现脱落现象，当年生嫩枝发生褐变；最后落叶松松苗全株枯萎，当年生嫩枝嫩叶颜色变红，针叶脱落现象明显加重。
当植物处于逆境胁迫环境时，会产生过多活性氧（ROS）。当活性氧累积过量时，会导致植物受到过氧化伤害，因此植物在逆境胁迫下抗氧化系统会被激活并分泌大量抗氧化酶进而抵御逆境带来的氧化伤害（Bang et al.，2009）。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）与过氧化物酶（Peroxidase，POD)是ROS水解过程中重要的4种氧化酶，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，能抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，使植物抵抗病害的能力增强，是植物体内重要的防御酶（戴凡炜等，2013）。其中，抗坏血酸过氧化物酶（APX）主要功能是清除细胞内的活性氧（Javeria et al.，2022），通过催化抗坏血酸（AsA）与过氧化氢的反应，维持植物体内的氧化还原平衡，保障植物正常生理功能（Song et al.，2023）。有研究在黑松、马尾松、火炬松上接种松材线虫后144 h内对松树的APX活性进行测定，3种松树在144 h内活性变化呈双峰状态（何龙喜等，2010）。FS处理组的APX活性变化与其相符，但3种落叶松的CD处理组APX活性均呈现缓慢上升的趋势，可能是因为CD虫株在侵染前期对落叶松树体影响并不大，与南方种群弱致病力的表现相符。同时，3种落叶松中日本落叶松APX活性变化幅度较小。过氧化氢酶（CAT）在植物体内发挥与APX酶类似的作用，促进过氧化氢的分解反应（Yu et al.，2023）。刘洪剑等（2018）对不同抗性的马尾松感染松材线虫后酶活性进行测定，发现高抗性家系马尾松的CAT活性在168 h内明显高于其他家系。本研究中3种落叶松的FS处理组在第7天CAT活性均高于南方种群，说明FS虫株对比CD虫株更能引起落叶松的防御反应。其中华北落叶松的CAT活性含量保持较高水平。苯丙胺酸解氨酶（PAL）主要参与植保素的合成（Gao et al.，2023）。陈玉惠等（2006）在马尾松上接种松材线虫后，线虫处理组PAL活性升高且PAL活性的高峰出现在外部症状表现之前。本研究中PAL活性的变化幅度显著超过了其他防御酶，证明了当松材线虫侵染落叶松早期，PAL主导的生理生化反应响应最为迅速。过氧化物酶（POD）能降解细胞内积累的过氧化氢以及有害的酚类和胺类物质，从而减轻它们的毒性效应（Xu et al.，2024）。先前的研究揭示，在接种初期阶段，这POD活性呈现出上升趋势，随后随着病程的发展，活性又表现出逐渐下降的规律性变化（张慧等，2014；陈雪莲，2015；刘洪剑等，2018）。华北落叶松的结果与之相符，但长白落叶FS处理组与日本落叶松则呈现出先上升后下降的趋势，这与刘洪剑等（2018）在马尾松上接种松材线虫后168h的变化相符。超氧化物歧化酶（SOD）在植物中发挥着重要的抗氧化和抗逆作用，有助于植物在不良环境条件下维持正常的生长和发育（王维等，2015）。有研究针对人工接种松材线虫的马尾松进行SOD活性测定。通过对比分析，发现接种后的马尾松其SOD活性相较于对照组呈现出显著的下降趋势（谢婉凤等，2018）。而曹业凡等（2020）在长白落叶松接种松材线虫后SOD活性的变化表现出先上升后下降的趋势。在本研究中，华北落叶松和长白落叶松的FS处理组均符合这一规律，但两种落叶松的CD处理组SOD活性变化幅度较小，与这一结果相符的是两种落叶松CD处理组早期并未显示出明显变化，说明了CD相较于FS的弱致病性。而日本落叶松线虫处理组的SOD活性较对照组低，说明侵染早期日本落叶松抗性较强。在5种酶活性中，SOD含量最高，说明松材线虫的入侵更能引起这3种落叶松体内SOD酶活性的变化响应。3种落叶松在松材线虫侵染后，APX、CAT、PAL、POD和SOD活性的变化差异可能与松材线虫诱发松树体内一系列反应，落叶松感染松材线虫后树体内的酶活性动态变化，在一定程度上能够反映3种落叶松间的抗性差异。由此说明，松材线虫侵染落叶松早期阶段，落叶松防御酶变化明显进而抵御线虫的侵入。针对不同地理种群的松材线虫侵染3种落叶松，松树表现出不同的防御反应，这有可能与松材线虫与松树的适应性进化相关。
综上所述，对于生长环境较为相同的3种落叶松，来自辽宁抚顺的松材线虫（FS虫株）致病性与来自湖南常德的松材线虫（CD虫株）致病性相比较强，且日本落叶松对两个地理种群松材线虫的抗性较华北落叶松、长白落叶松较强，后续也将进一步探究南北不同种群松材线虫对落叶松致病性差异的分子机制。
附录：附图 1 感病华北落叶松表症变化
附图 2 感病长白落叶松表症变化
附图 3 感病日本落叶松表症变化
详细数据见网络版增强出版材料（http://hjkcxb.alljournals.net/）
附图 1 感病华北落叶松表症变化注：（a），接种CD虫株；（b），接种FS虫株；1 d，接种后第1天；7 d，接种后第7天；15 d，接种后第15天；21 d，接种后第21天；30 d，接种后第30天。Appendix Fig. 1 Symptom progression of infected seedlings of Larix principis-rupprechtiiNote: (a), Inoculated with the CD strain; (b), Inoculated with the FS strain; 1 d, 7 d, 15 d, 21 d, 30 d: Days post-inoculation.下载:
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附图 2 感病长白落叶松表症变化注：（a），接种CD虫株；（b），接种FS虫株；1 d，接种后第1天；7 d，接种后第7天；15 d，接种后第15天；21 d，接种后第21天；30 d，接种后第30天。Appendix Fig. 2 Symptom progression of infected seedlings of Larix olgensisNote: (a), Inoculated with the CD strain; (b), Inoculated with the FS strain; 1 d, 7 d, 15 d, 21 d, 30 d: Days post-inoculation.下载:
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附图 3 感病日本落叶松表症变化注：（a），接种CD虫株；（b），接种FS虫株；1 d，接种后第1天；7 d，接种后第7天；15 d，接种后第15天；21 d，接种后第21天；30 d，接种后第30天。Appendix Fig. 3 Symptom progression of infected seedlings of Larix kaempferiNote: (a), Inoculated with the CD strain; (b), Inoculated with the FS strain; 1 d, 7 d, 15 d, 21 d, 30 d: Days post-inoculation.下载:
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图 1 落叶松针叶含水量变化
注：CD，接种CD虫株；FS，接种FS虫株；CK，对照组，接种无菌水。同组不同字母表示差异显著（P < 0.05）。下同。
Fig. 1 Changes in water content of Larix spp. needles
Note: CD, inoculated with the CD strain; FS, inoculated with the FS strain; CK, Control group, inoculated with sterile water. Different letters in the same group indicated significant differences (P < 0.05). Same below.
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图 2 落叶松松茎含水量变化
Fig. 2 Changes in water content of Larix spp. stems
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图 3 落叶松叶绿素含量变化
Fig. 3 Changes in chlorophyll content of Larix spp.
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图 4 侵染早期落叶松防御酶活性变化
Fig. 4 Changes in defense enzyme activity of Larix spp. during early infection
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附图 1 感病华北落叶松表症变化
注：（a），接种CD虫株；（b），接种FS虫株；1 d，接种后第1天；7 d，接种后第7天；15 d，接种后第15天；21 d，接种后第21天；30 d，接种后第30天。
Appendix Fig. 1 Symptom progression of infected seedlings of Larix principis-rupprechtii
Note: (a), Inoculated with the CD strain; (b), Inoculated with the FS strain; 1 d, 7 d, 15 d, 21 d, 30 d: Days post-inoculation.
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附图 2 感病长白落叶松表症变化
注：（a），接种CD虫株；（b），接种FS虫株；1 d，接种后第1天；7 d，接种后第7天；15 d，接种后第15天；21 d，接种后第21天；30 d，接种后第30天。
Appendix Fig. 2 Symptom progression of infected seedlings of Larix olgensis
Note: (a), Inoculated with the CD strain; (b), Inoculated with the FS strain; 1 d, 7 d, 15 d, 21 d, 30 d: Days post-inoculation.
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附图 3 感病日本落叶松表症变化
注：（a），接种CD虫株；（b），接种FS虫株；1 d，接种后第1天；7 d，接种后第7天；15 d，接种后第15天；21 d，接种后第21天；30 d，接种后第30天。
Appendix Fig. 3 Symptom progression of infected seedlings of Larix kaempferi
Note: (a), Inoculated with the CD strain; (b), Inoculated with the FS strain; 1 d, 7 d, 15 d, 21 d, 30 d: Days post-inoculation.
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表 1 落叶松接种后30天内发病率、病情指数及分离松材线虫数量
Table 1 Incidence rate, disease index and number of Bursaphelenchus xylophilus recovered from Larix spp. at 30 days post-inoculation
寄主类型
Host species松材线虫种类
B. xylophilus strain首次发病时间（d）
First symptom onset (days)接种15 d 15 d post-inoculation 接种30 d 30 d post-inoculation 发病率（%）
Incidence rate病情指数
Disease index分离松材线虫数量（条）
Number of B. xylophilus recovered发病率（%）
Incidence rate病情指数
Disease index分离松材线虫数量（条）
Number of B. xylophilus recovered华北落叶松
Larix principis-rupprechtiiCD 7 33.3 25.0 1570 ± 143 a 100.0 90.0 4 950 ± 387 a FS 5 33.3 33.3 780 ± 86 b 100.0 100.0 2 520 ± 248 b 长白落叶松
Larix olgensisCD 12 33.3 8.3 450 ± 57 a 100.0 85.0 1 100 ± 97 a FS 9 33.3 33.3 440 ± 101 a 100.0 100.0 1 530 ± 329 a 日本落叶松
Larix kaempferiCD 11 33.3 33.3 520 ± 93 b 85.7 82.1 1 155 ± 374 b FS 13 66.7 16.7 800 ± 132 a 100.0 96.4 2 600 ± 225 a 注：数值表示平均值±标准误，不同字母表示差异显著，t检验（P＜0.01）。Note: Values represented mean ± SE, and different letters within a row indicated significantly different according to t test, P < 0.01. -
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