Functional characterization of the SlSMARCE1 gene in Spodoptera litura and its RNA interference effects
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摘要:目的
SMARCE1是形成染色质重塑复合物核心的重要组成，在基因表达、细胞分裂等生物过程中发挥重要作用。为了明确SMARCE1基因在斜纹夜蛾Spodoptera litura发育过程中的功能，本研究克隆获得了斜纹夜蛾SlSMARCE1基因，该基因所编码的蛋白质含570个氨基酸残基。
方法多重序列比对和系统发育分析表明，SlSMARCE1蛋白与其他昆虫的SMARCE1蛋白具有高度保守性和同源性。在斜纹夜蛾幼虫的生长和发育过程中，SlSMARCE1主要在3龄幼虫阶段表达，5龄幼虫不同组织中的表达结果显示，SlSMARCE1在中肠中具有高表达水平。为了验证SlSMARCE1的功能，本研究探究了斜纹夜蛾SlSMARCE1基因的特性及其在RNA干扰条件下的生物学效应。
结果结果表明，在幼虫发育过程中，RNA干扰使SlSMARCE1沉默可显著抑制斜纹夜蛾幼虫的生长发育，导致幼虫体重下降，体型变小。此外，向1龄末幼虫喷洒dsSlSMARCE1后，幼虫在72 h内的存活率为55%，且RNAi通路的关键基因Ago与Dicer的表达显著升高。
结论这些结果不仅表明SlSMARCE1在斜纹夜蛾的生长发育过程中具有重要的作用，同时还为利用RNAi技术防控斜纹夜蛾提供新的靶标基因，为在农业害虫防治中减少对化学杀虫剂的依赖提供了新思路。
Abstract:AimSMARCE1, an essential component that forms the core of chromatin remodeling complexes, plays a significant role in various biological processes including gene expression regulation and cell division. To elucidate the functional role of SMARCE1 in the developmental process of Spodoptera litura, we cloned and characterized the SMARCE1 gene in this study. The protein it encodes consists of 570 amino acid protein residues.
MethodsMultiple sequence alignment and the phylogenetic analysis revealed that SlSMARCE1 protein exhibited a high degree of conservation and significant homology with SMARCE1 proteins in other insects. During S. litura larval development, SlSMARCE1 exhibited stage-specific expression with peak levels observed in third-instar larvae. Tissue-specific profiling in fifth-instar larvae revealed predominant SlSMARCE1 expression in the midgut. To verify the function of SlSMARCE1, this study investigated the characteristics of the gene in S. litura and its biological effects under RNA interference.
ResultsThe results showed that silencing of SlSMARCE1 by RNA interference significantly inhibited the growth and development, decreased larval weight and size of S. litura larvae during larval development. Furthermore, after spraying dsSlSMARCE1 to larvae at the end of the 1st instar, the survival rate of larvae was 55% within at 72 h, and the expression of Ago and Dicer, key genes of the RNAi pathway elevated significantly.
ConclusionThese results not only demonstrate that SlSMARCE1 has an important role in the growth and development of S. litura, but also provide new target genes for the prevention and control of the S. litura using RNAi technology, and provide a promising strategy for reducing the reliance on chemical insecticides in agricultural pest control.
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Keywords:
- Spodoptera litura /
- RNA interference /
- SMARCE1 /
- spatiotemporal expression /
- biological control
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斜纹夜蛾Spodoptera litura（Fabricius），隶属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，又名莲纹夜蛾，是一种重要的多食性害虫，因其寄主范围极广而闻名（Ahmad et al.，2007）。它有4个发育阶段，包括卵期、幼虫期、蛹期和成虫期，其中幼虫期是取食和为害作物的关键时期（Fouchier et al.，2018；Li et al.，2021；Xia et al.，2023），主要为害全球热带和亚热带地区的近390种重要经济作物，如玉米、花生、烟草、大豆、棉花和十字花科蔬菜等（Matsuura et al.，1997；Su et al.，2012；Wang et al.，2025），主要啃食叶片，引发叶片缺失甚至植株无叶（李丽霞等，2025）。据统计，该虫常年造成10%~30%的作物产量损失，给全球经济造成重大损失（Cheng et al.，2017）。国外在东南亚和南亚地区较为常见，国内则以黄河和长江流域的情况相对严重（姚文辉，2005）。
在防治斜纹夜蛾的策略上，当前仍以化学杀虫剂为主（Ahmad et al.，2015；Saleem et al.，2016）。然而，鉴于化学杀虫剂存在环境污染、农药残留、食品安全隐患等问题（Tong et al.，2025），同时长期的化学防治导致斜纹夜蛾对各种传统杀虫剂，如有机磷类（毒死蜱）、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类（β-氯氰菊酯）和新型化学杀虫剂多杀菌素、茚虫威、甲氧虫酰肼和灭多威等杀虫剂（Saleem et al.，2008；Tong et al.，2013；Sang et al.，2016）产生了不同程度的抗药性，甚至交叉抗药性（Gong et al.，2022）。害虫抗药性的快速演变，严重影响着害虫的有效管理、杀虫剂的可持续使用、环境甚至人类健康（Mpumi et al.，2020）。因此，开发更安全、更环保的方法对有效控制斜纹夜蛾非常重要。
在昆虫中，RNA干扰（RNA interference，RNAi）已被广泛用于研究基因的功能，以理解参与生长、发育和抗毒素的蛋白质的功能（Hu et al.，2014；Guo et al.，2015；Kim et al.，2015；Wang et al.，2015）。RNAi是指一种由双链RNA（dsRNA）介导的高度保守的细胞机制，其中Argonaute（Ago）家族蛋白与小RNA结合，通过序列互补性触发长RNA的降解（Zhu et al.，2020）。在昆虫体内传递dsRNA可诱导RNAi途径的级联，通过该途径，Dicer-2酶将dsRNA分解成siRNA片段，这些siRNA片段与RNA诱导的沉默复合体（RISC）结合，RISC可识别目标mRNA，与之结合并触发同源内源性mRNA的降解（Huvenne et al.，2010；Lin et al.，2017）。双链RNA在触发RNAi方面非常有效，可通过微量注射、喷雾或饲喂的方式传递（Zhang et al.，2013）。自Fire等人首次在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans中发现这一过程以来，通过双链RNA诱导的RNAi基因敲除已被广泛应用于害虫治理（Fire et al.，1998）。例如，通过向茶翅蝽Halyomorpha halys若虫注射dsHhlac2抑制Hhlac2基因的表达，会导致若虫表皮颜色变浅，死亡率超过90%（Dang et al.，2025）。在小地老虎Agrotis ypsilon中敲低AiGSTz1基因的表达后，导致幼虫对丁硫克百威的抗药性显著降低，死亡率增加（Liu et al.，2024）。在对赤拟谷盗Tribolium castaneum的研究中，通过RNA干扰技术沉默其5个海藻糖酶基因，发现这些基因的表达显著下降，导致昆虫出现蜕皮畸形，死亡率高达17%~42%（Tang et al.，2016）。此外，几乎在所有真核生物中都发现了RNAi现象，而且这种现象高度保守（Agrawal et al.，2003）。大量研究证实，物种特异性dsRNA可成功抑制目标昆虫的特定基因，而不会影响非目标昆虫（Pitino et al.，2011；Bachman et al.，2013；Wu et al.，2023）。
近年来，染色质重塑复合物（SWItch/Sucrose Non-Fermentable，SWI/SNF）在生物体内所起的作用越来越受到关注。该复合物通过与DNA结合的调节蛋白相互作用，以ATP依赖的方式修饰核小体结构，从而在基因表达调控和染色质结构重塑中发挥重要作用（Sokol et al.，2017）。构成SWI/SNF复合体的亚基有10多个，包括BAF57（SMARCE1）、BRG1（SMARCA4）、BRM（SMARCA2）、SNF5/Ini（SMARCB1）等，其中BRG1或BRM为催化亚基（Wang et al.，2007；He et al.，2017）。SMARCE1基因作为编码ATP依赖性染色质重塑复合物SWI/SNF的核心亚基，位于染色体18，含有一个DNA结合HMG结构域（Hu et al.，2022），在许多生物过程中发挥作用（Tsukiyama，2002；Clapier et al.，2017；Forest et al.，2022），包括调控生物体细胞的细胞周期进程、基因表达、DNA复制、发育、分化、延伸、信号传导、剪接和DNA损伤修复（Underhill et al.，2000；Ruijtenberg et al.，2015）。目前，该基因在人类癌症中的研究较为深入，但在昆虫领域的研究相对较少。有研究表明，在人体乳腺癌细胞中，通过RNA干扰技术抑制SMARCE1的表达后，发现雌激素刺激的细胞在3 d后停止增殖，7 d后细胞生长减少了50%，表明SMARCE1对于雌激素依赖的基因表达、细胞增殖以及雌激素受体介导的转录调控具有至关重要的作用（Garcia-Pedrero et al.，2006）。鉴于其在细胞调控中的关键作用，SMARCE1基因有望成为害虫防治策略的有效靶标。
本研究从斜纹夜蛾转录组数据库中比对并筛选获得SlSMARCE1的基因序列，对其氨基酸序列进行了表征和分析。其次通过逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR），克隆并鉴定了斜纹夜蛾4龄幼虫SlSMARCE1基因的互补DNA（cDNA），用于进一步分析。然后通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术定量分析该基因在不同发育阶段和组织的时空表达谱。此外，使用RNA干扰技术进一步研究了沉默SlSMARCE1对斜纹夜蛾生长发育的影响。这些结果有力地表明了SlSMARCE1在斜纹夜蛾生长发育过程中的重要作用，以及该基因用于RNA干扰生物农药的潜在作用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试昆虫：斜纹夜蛾购买自河南省济源白云实业有限公司，饲养于中国科学院分子植物科学卓越创新中心人工气候箱中。幼虫使用人工饲料进行饲养，成虫用10%蜂蜜水饲喂以进行产卵，饲养条件如下：温度（26 ± 1）℃，相对湿度（70 ± 5）%，光周期为16 L∶8 D。
1.2 主要试剂及仪器
试剂：总RNA提取试剂TRIzol® reagent、T7 RNA Translation Kit、MagBeads dsRNA Purification Kit、2×Universal SYBR Green qPCR Master Mix（With Seperate ROX）荧光定量试剂盒和无酶水，均购自上海泊朗生物技术有限公司；反转录试剂盒ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，购自日本ToYoBo公司；Taq酶2×Hieff® Ultra-Rapid Ⅱ HotStart PCR Master Mix，购自上海翌圣生物科技有限公司；DH5α感受态细胞，购自上海唯地生物技术有限公司；其余试剂均国产分析纯。
主要仪器设备：SHP-250型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；PH-070A型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；多样品组织研磨仪，上海净信实业发展有限公司；液相（针尖平头）微量进样器，上海高鸽工贸有限公司；Nanodrop 2000超微量分光光度计，美国Thermo Scientific公司；JY04S-3C型凝胶电泳仪及成像设备，北京君意东方电泳设备有限公司。
1.3 总RNA提取及cDNA合成
根据TRIzol® reagent说明书中的操作提取斜纹夜蛾4龄幼虫总RNA。所得RNA溶液使用紫外分光光度计检测浓度，再经1%凝胶电泳检测其质量，检测合格后将RNA存于-80℃冰箱用于后续实验。取1 μg RNA样品，通过反转录试剂盒ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover合成第一链cDNA，反应条件和步骤与制造商提供的说明书相同，合成后将其冷冻于-20℃冰箱，用来进行后续的基因克隆及荧光定量PCR检测。
1.4 斜纹夜蛾SMARCE1基因的克隆
根据斜纹夜蛾转录组数据（未发表）比对并筛选获得斜纹夜蛾SMARCE1基因序列，并通过NCBI ORF Finder软件和NCBI网站的BLAST确认其开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），再运用NCBI数据库中的Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/-primer-blast/）在线程序设计扩增SMARCE1基因全长开放阅读框的引物，用于PCR扩增及dsRNA合成。所用引物均由上海铂尚生物技术有限公司合成，其序列如下（表 1）。以斜纹夜蛾cDNA模板，利用Taq酶进行PCR扩增，PCR反应体系及条件等见表 2。
表 1 本研究所用引物列表Table 1 Primers used in this study基因Genes 引物序列（5'-3'）Primer sequences 目的Purpose SMARCE1-F ACAACTCGCCCGCGTATTTA PCR扩增及dsRNA合成
PCR Amplification and dsRNA SynthesisSMARCE1-R TGTTCTATCGCTCGCTCCAC SMARCE1-qF CACCACACATCACGTCTCCA RT-qPCR SMARCE1-qR GTAGTAACGTCCGCCGTAGG GAPDH-qF GGGTATTCTTGACTACAC RT-qPCR GAPDH-qR CTGGATGTACTTGATGAG UCCR-qF GCCAAGATTGAGATCAAG RT-qPCR UCCR-qF GCATACTCCGATAACTAC EF1α-qF CGAAACCGCTAAATACTATGTCAC RT-qPCR EF1α-qR AACGGGATTCGCTGTATGG RPL10-qF GACTTGGGTAAGAAGAAG RT-qPCR RPL10-qR GATGACATGGAATGGATG 表 2 PCR扩增体系Table 2 PCR amplification system试剂Reagent 体积（μL）Volume PCR反应程序PCR Protocol 2×Hieff® Ultra-Rapid Ⅱ HotStart PCR Master Mix 25 95℃预变性3 min Initial Denaturation: 95℃ for 3 min Nuclease-free water 20 $ 35 \times\left\{\begin{array}{l} 95\text {℃变性15}\mathrm{~s} \text { Denaturation: } 95℃ \text { for } 15 \; \mathrm{sec} \\ 58\text {℃退火20}\mathrm{~s} \text { Annealing: } 58℃ \text { for } 20 \; \mathrm{sec} \\ 72\text {℃延伸1}\mathrm{~kb} / \mathrm{s} \text { Extension: } 72℃ \text { at } 1 \mathrm{~kb} / \mathrm{s} \end{array}\right. $ Forward primer 2 Reverse primer 2 cDNA Template 1 72℃终延伸5 min Final Extension: 72℃ for 5 min Total volume 50 4℃保存Hold: 4℃ 反应结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化获得纯化产物。将测序正确的产物与pESI-T载体于室温连接5 min，加入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，于超净台中加入不含抗生素的LB培养基后，放入37℃ 200 rpm摇床中震荡培养10 min，涂布到含有氨苄的LB固体平板后于37℃培养箱过夜培养，挑取阳性单克隆菌落，加入含氨苄的LB液体培养基，进行PCR菌液鉴定并提取质粒。将鉴定为阳性克隆的菌液送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序，并利用Snapgene软件和原序列比对获得正确的斜纹夜蛾SMARCE1基因序列。
1.5 斜纹夜蛾SMARCE1基因的序列分析
利用SignalP-6.0软件（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）进行斜纹夜蛾SMARCE1基因编码蛋白质序列信号肽预测；利用EXPASY软件（https://www.expasy.org/）计算斜纹夜蛾SMARCE1基因编码蛋白质的大小及等电点；利用SWISS-MODEL软件（https://swissmodel.expasy.org/interactive）对斜纹夜蛾SMARCE1基因编码蛋白质进行同源建模及蛋白质三维结构预测分析；亚细胞定位（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）；蛋白质二级结构（https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.ht-ml）；通过在线工具NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载不同昆虫的SMARCE1基因序列进行序列比对和系统发育分析。用于该分析的昆虫物种包括斜纹夜蛾（XP_022823517.1）、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（XP_050551896.1）、家蚕Bombyx mori（XP_062528045.1）、甜菜夜蛾Spodoptera exigua（CAH0663760.1）、棉铃虫Helicoverpa armigera（XP_063895445.1）、烟草天蛾Manduca sexta（XP_030040665.1）、小菜蛾Plutella xylostella（XP_048481310.1）、西方蜜蜂Apis mellifera（XP_395543.4）、墨西哥兰花蜂Eufriesea mexicana（XP_017754703.1）、黑腹果蝇Drosophila melanogaster（NP_572530.1）、桔小实蝇Bactrocera dorsalis（XP_011202379.2）、黎巴嫩花果蝇Scaptodrosophila lebanonensis（XP_030386707.1）、马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata（XP_023023681.1）、赤拟谷盗Tribolium castaneum（XP_015834673.1）、褐飞虱Nilaparvata lugens（XP_039295195.1）、灰飞虱Laodelphax striatellus（RZF46964.1）、茶翅蝽Halyomorpha halys（XP_014282572.1）。使用MEGA 12.0软件分析斜纹夜蛾SMARCE1基因编码蛋白质的序列一致性，并通过GeneDoc软件显示；进一步采用MEGA 12.0软件的邻接法构建系统进化树，Bootstrap值设为1 000。
1.6 斜纹夜蛾SMARCE1基因的时空表达分析
分别收集斜纹夜蛾不同发育阶段幼虫期（1~6龄）、预蛹期（1~7 d）及蛹期（1~3 d）的全虫，将所有样本在液氮中冷冻后储存在-80℃冰箱，用于总RNA提取。同时解剖5龄幼虫的头、表皮、脂肪体、中肠及血淋巴组织进行SMARCE1基因的时空表达分析。为消除个体差异，每组样本设3个生物学重复，每3个同一发育时期的整虫/组织作为一个样本，所有样品的RNA提取和cDNA合成方法同1.3。在此基础上，采用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）技术检测斜纹夜蛾SMARCE1基因的时空表达分析。
1.7 dsRNA的制备和RNA干扰生物测定
选取1.3克隆的斜纹夜蛾SMARCE1基因全长ORF序列中的一段核苷酸序列（446~938，493 bp），进行dsRNA合成及RNA干扰试验。使用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）作为阴性对照。通过NCBI数据库中的Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线程序设计含T7启动子序列的引物（表 1）。使用dsRNA合成试剂盒T7 RNA Translation Kit，参照说明书合成2种dsRNA，并使用磁珠纯化试剂盒MagBeads dsRNA Purification Kit进行纯化，将得到的dsRNA溶于无核酸酶的水中，使用琼脂糖凝胶电泳鉴定dsRNA的完整性，并使用Nano Drop 2000分光光度计测量浓度。
为了进行RNAi生物测定，根据预试验结果，将dsRNA的最终浓度调节至8 µg/µL，用于注射及喷洒。使用微量注射器将4 μL dsRNA注射到斜纹夜蛾2日龄的3龄幼虫血淋巴中，将注射的幼虫维持在普通人工饲料（5 mm × 5 mm × 5 mm）上，每天更换饲料。其中注射dsSMARCE1为处理组，注射dsEGFP为对照组。在注射后6、12、24和36 h分别收集幼虫进行取样，样品在液氮中冷冻后储存在-80℃冰箱，用于总RNA提取和cDNA合成，方法同1.3。在此基础上，采用qPCR技术评估dsSMARCE1对基因表达的影响，并使用分析天平连续5 d称取记录每头昆虫的体重。为消除个体差异，每组样本设3个生物学重复，每个重复处理10头斜纹夜蛾3龄幼虫，每3头虫作为一个样本。另取3日龄的1龄幼虫，用毛刷将其刷入25 mL养虫盒（3.7 cm × 2.9 cm × 3.3 cm）中，并在其底部放入薄片饲料。使用微量喷雾器将100 μL dsRNA均匀喷洒于1龄幼虫表面，每隔5 min喷1次，共喷洒5次。分别于喷洒1、2、3、4和5 d后统计斜纹夜蛾幼虫的死亡数量，计算死亡率，分析dsSMARCE1对斜纹夜蛾的致死效果。每个处理3次重复，每个重复30头斜纹夜蛾1龄幼虫。
1.8 实时荧光定量PCR检测
分别收集所有样品（斜纹夜蛾不同发育阶段幼虫、不同组织及不同处理后的幼虫）用于总RNA的提取及第一链cDNA合成，方法同1.3。根据制造商的说明书，采用ABI7500实时荧光定量PCR仪系统，通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）技术进行斜纹夜蛾SMARCE1基因的表达分析。以斜纹夜蛾GAPDH基因和UCCR基因作为幼虫中基因相对表达量的内参基因，以EF1α基因和RPL10基因作为不同组织中基因相对表达量的内参基因（Lu et al.，2013），进行均一化处理，并根据2-ΔΔCT方法（Livak and Schmittgen, 2001）进行数据分析，计算目的基因的相对表达水平。以稀释至500 ng/µL的cDNA作为模板，构建总体积为20 µL的反应体系：2 × Universal SYBR Green qPCR Master Mix 10 µL、cDNA模板2 µL、SMARCE1 qF 0.4 µL、SMARCE1 qR 0.4 µL、Nuclease-free water 7.2 µL。热循环反应条件为：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火和延伸30 s，共40个循环。熔解程序：快速升温至95℃变性15 s，降温至60℃退火15 s，将反应体系缓慢升温至95℃保持15 s。反应结束后，确认qRT-PCR的熔解曲线和扩增曲线正常。本研究中使用的所有基因序列均获自NCBI数据库，用于qRT-PCR的所有引物均利用NCBI设计，并列于表 1中。为消除差异，设3次生物学重复制备RNA样本，3次技术重复进行qRT-PCR实验。
1.9 数据统计与分析
试验数据运用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和独立样本Student's t-test对不同处理之间的差异进行差异显著性分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.01认为有显著性差异，P＞0.05认为无统计学意义差异，用ns（not significant）表示。使用GraphPad Prism 8.0软件绘图。每个试验独立重复3次，数值表示为3个独立试验的平均值±标准差。
2. 结果与分析
2.1 SlSMARCE1基因特征与氨基酸序列分析
基于斜纹夜蛾转录组数据（未发表），通过RT-PCR技术利用基因特异性引物扩增，并对PCR产物进行测序，得到斜纹夜蛾的SlSMARCE1基因序列，命名为SlSMARCE1。SlSMARCE1 ORF全长1 713 bp，共编码570个氨基酸序列，预测其编码蛋白质的分子量为61.66 kDa，理论等电点pI为6.30，为酸性蛋白，蛋白的疏水性系数为-0.953，属于亲水蛋白。不稳定系数为64.18，大于40，该蛋白不可稳定存在。氨基酸组成分析表明，脯氨酸（Pro）是20种常见的氨基酸中最丰富的，占比13.5%，其次是丙氨酸（Ala；11.6%），半胱氨酸（Cys）最不丰富，占比0.2%。信号肽预测结果表明该基因无信号肽，亚细胞定位预测SlSMARCE1位于细胞核中。利用MEGA 12.0和GeneDoc软件将SlSMARCE1的蛋白质序列与来自鳞翅目的3种不同昆虫的SMARCE1进行序列比对分析。结果表明，SlSMARCE1与草地贪夜蛾的SMARCE1最相似，具有94.2%的同源性，其次是棉铃虫，具有80.2%的同源性，最后是家蚕，具有70%的同源性（图 1）。
图 1 SlSMARCE1蛋白与不同昆虫同源蛋白的氨基酸序列比对分析注：保守结构域HMG（High mobility group box domain）用绿色框表示；黑色背景氨基酸序列一致；深灰色背景氨基酸序列相似性在70%以上；浅灰色背景氨基酸序列在50%以上；比对中使用的氨基酸序列如下：S. l：斜纹夜蛾（XP_022823517.1）；S. f：草地贪夜蛾（XP_050551896.1）；H. a：棉铃虫（XP_063895445.1）；B. m：家蚕（XP_062528045.1）。Fig. 1 Multiple sequence alignment of SlSMARCE1 with homologous proteins from other insect speciesNote: The conserved HMG-box domain was indicated with green box. Amino acids identical in all sequences were shaded in black. Positions with > 70% and > 50% similarity were shaded in dark gray and light gray, respectively. Amino acid sequences used in the alignment were as follows: S. l: Spodoptera litura (XP_022823517.1); S. f: Spodoptera frugiperda (XP_050551896.1); H. a: Helicoverpa armigera (XP_063895445.1); B. m: Bombyx mori (XP_062528045.1).
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2.2 SlSMARCE1的结构预测及系统发育树分析
根据NCBI网站检索现有的昆虫SMARCE1氨基酸序列信息，选取了来自鞘翅目Coleoptera、鳞翅目Lepidoptera、膜翅目Hymenoptera、双翅目Diptera与半翅目Hemiptera共5个目昆虫的17条SMARCE1氨基酸序列共同构建系统发育树（图 2-A）。结果显示斜纹夜蛾SlSMARCE1与其它鳞翅目昆虫的SMARCE1同源性较高，其中与草地贪夜蛾的SMARCE1聚为一支，亲缘关系最近。
图 2 基于SMARCE1氨基酸序列构建斜纹夜蛾与其他昆虫的系统进化树（A）、SlSMARCE1蛋白三维结构（B）及保守结构域预测（C）Fig. 2 Phylogenetic tree of Spodoptera litura and related insects based on SMARCE1 animo acids sequences (A) and prediction of the three-dimensional structure of SlSMARCE1 protein (B) and the conserved domain (C)下载:
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斜纹夜蛾SlSMARCE1的蛋白二级结构中α螺旋占32.11%，延伸链占1.58%，无规则卷曲占66.32%。利用SWISS-MODEL在线工具对斜纹夜蛾SlSMARCE1蛋白质进行三维结构建模，通过比对PDB数据库公布的1781个模板，获得三维结构图（图 2-B），与已知的SMARCE1基因的氨基酸序列相似度为57%，并且覆盖93%的氨基酸序列。保守结构域预测表明该转录因子属于高迁移率蛋白超家族，因为SlSMARCE1的蛋白结构中含有一个HMG结构域（80-150）（图 2-C）。
2.3 SlSMARCE1基因发育阶段和组织的表达特异性
利用qRT-PCR技术对斜纹夜蛾SlSMARCE1基因进行时空表达分析，结果表明，SlSMARCE1在幼虫发育的不同阶段、预蛹和蛹阶段均有表达，以1龄幼虫该基因的表达量为对照，发现幼虫阶段SlSMARCE1在3龄幼虫中较高地表达，在蛹期表达量最高（图 3-A）。对于组织表达分析，SlSMARCE1在5种组织中均表达，以头部该基因的表达量为对照，SlSMARCE1在中肠中显示出最高的表达水平，其次是表皮和血淋巴，且与该基因在头部的相对表达量接近，而在脂肪体中的表达最低（图 3-B）。
图 3 斜纹夜蛾SlSMARCE1基因的时空表达分析注：图中数据表示为三个独立生物学重复的平均值±标准误，误差棒表示标准误。处理组与对照组之间的差异显著性分析采用Student's t-test进行分析，并用星号表示。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。图 4、图 5同。Fig. 3 Spatiotemporal expression analysis of Spodoptera litura SlSMARCE1 geneNote: Data were presented as the Mean ± SE of three independent biological replications, and error bars indicated standard errors. Significant differences between treatment groups and control were analyzed by Student's t-test and expressed by the asterisk. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. Same to Fig. 4 and Fig. 5.下载:
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2.4 SlSMARCE1基因的RNAi效应
为了研究SlSMARCE1在斜纹夜蛾幼虫发育过程中的作用，利用RNAi技术通过注射dsRNA来抑制SlSMARCE1的表达。通过qRT-PCR检测RNA干扰后SlSMARCE1的沉默效率。与dsEGFP对照组相比，注射dsSlSMARCE1的斜纹夜蛾3龄幼虫SlSMARCE1的基因表达量显著下调。在干扰后的6、12、24和36 h，沉默效率分别为17.93%（P=0.006），34.59%（P=0.000008），59.05%（P=0.0000004），36.87%（P=0.0006）（图 4-A），结果表明，注射dsSlSMARCE1能够显著降低SlSMARCE1的表达量，具有显著的沉默效果。SlSMARCE1沉默后，与dsEGFP相比，幼虫的体重从1~5 d也显著降低，并且差异持续增加（图 4-B），注射后第3天幼虫体型显著减小（图 4-C）。这些结果表明，注射dsRNA后，斜纹夜蛾体内的SlSMARCE1被成功敲低，具有显著的沉默效果，并导致幼虫生长缓慢，体重减轻。
图 4 沉默SlSMARCE1对斜纹夜蛾SlSMARCE1基因表达（A）及幼虫发育（B，C）的影响Fig. 4 Effect of silencing SlSMARCE1 on the expression of SlSMARCE1 (A) and larval development (B, C) in Spodoptera litura下载:
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与此同时，相比于喷洒dsEGFP对照组，喷洒dsSlSMARCE1的斜纹夜蛾1龄幼虫SlSMARCE1基因表达量显著降低，RNAi通路关键基因Ago和Dicer的表达均显著升高（图 5-A）。生物测定结果表明，喷洒dsEGFP 48 h后，幼虫存活率稳定在95%，喷洒dsSlSMARCE1后第3天，幼虫存活率为55.16%（图 5-B）。这些结果均表明，SlSMARCE1在斜纹夜蛾幼虫的生长发育过程中发挥着关键作用，可能成为害虫控制策略的潜在目标。
图 5 喷洒dsSlSMARCE1对斜纹夜蛾RNAi相关基因表达（A）及死亡率（B）的影响Fig. 5 Effect of spraying dsSlSMARCE1 on the expression of RNAi-related genes (A) and mortality (B) in Spodoptera litura下载:
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3. 结论与讨论
斜纹夜蛾是全球危害最严重的农业害虫之一，由于频繁使用化学杀虫剂，导致抗药性不断增加，面临环境污染、农药残留等问题，从而给斜纹夜蛾的防治工作带来了严峻的挑战（Wang et al.，2025）。因此，开发新型、环保、高效的防治方法尤为重要，基于RNA干扰的害虫生物防治技术显示出广阔的应用前景，在此之中确定参与昆虫发育过程中所必需的关键基因非常重要（Mehlhorn et al.，2021）。本研究通过PCR技术克隆并验证了编码SlSMARCE1的开放阅读框ORF序列，该基因是SWI/SNF复合物的一个外周亚基，又称为BAF57（Feng et al.，2021），SWI/SNF家族是一类大型ATP依赖性染色质重塑复合体，通过改变染色质的结构，使得转录因子能够更容易地结合到DNA上（Sacharowski et al.，2025），从而在许多生物过程中发挥重要作用，包括基因表达、基因调控、DNA复制、DNA修复、DNA重组和细胞分裂（Kazantseva et al.，2009；Euskirchen et al.，2012；Heo et al.，2020）。该基因的氨基酸序列具有与其他昆虫SMARCE1基因典型的DNA结合HMG结构域（图 2-C），该保守结构域位于蛋白质序列的N端，SMARCE1可能通过该结构域引导SWI/SNF复合体结合到适当的基因组区域，形成适合转录调控的染色质结构，从而参与染色质的重塑过程（Pan et al.，2007）。亚细胞定位预测结果显示该基因位于细胞核中。在斜纹夜蛾SlSMARCE1氨基酸序列的二级结构中，SlSMARCE1的α螺旋的比例为32.11%，预测其三维结构，发现斜纹夜蛾SlSMARCE1的氨基酸序列含有7个α螺旋。多序列比对分析表明，SlSMARCE1与其他鳞翅目昆虫的蛋白质序列同源性为70%~94.2%（图 1）。对17个昆虫SMARCE1同原序列的系统进化分析表明，SlSMARCE1与草地贪夜蛾、甜菜夜蛾等鳞翅目昆虫SMARCE1的同源性较高（图 2-A）。结果表明，SlSMARCE1基因在鳞翅目昆虫中是保守的，推测该基因在鳞翅目昆虫的生长发育和生理功能中发挥着相似的作用。因此，针对该基因的RNA干扰技术不仅可能对斜纹夜蛾有效，还可能对其他鳞翅目害虫具有潜在的防治效果。这一发现为开发广谱的RNA生物农药策略提供了重要的理论基础，有望为多种鳞翅目害虫的综合防治提供新的思路和方法。
为了进一步研究SlSMARCE1的功能，分析了该基因在斜纹夜蛾不同发育阶段及组织的特异性表达模式。结果表明，斜纹夜蛾SlSMARCE1基因在不同发育阶段均有表达，推测其可能在昆虫整个生命周期中都发挥着重要作用。在幼虫发育时期的3龄阶段表达量最高（图 3-A），这可能是由于在该阶段昆虫正处于快速生长和发育的时期，推测该基因的高表达可能与细胞生长、增殖与组织分化等过程有关。在预蛹及蛹阶段高表达（图 3-A），这可能是由于昆虫开始从幼虫形态向成虫形态转变，推测该基因可能与这一形态转变过程中的细胞重塑、组织重构等密切相关（Smith et al.，2017）。中肠是昆虫消化和吸收营养物质的主要器官（Hakim et al.，2010），SMARCE1基因在中肠的高表达表明它可能参与调控中肠细胞的营养代谢活动，确保中肠能够高效地吸收和处理营养物质（图 3-B）。因此推测SlSMARCE1可能参与了斜纹夜蛾整个生命周期的生长发育，这种时空特异性的表达模式为深入研究SlSMARCE1基因的功能提供了重要基础，并且为开发针对该基因的害虫防治策略提供了潜在靶点。
本研究通过RNAi技术沉默斜纹夜蛾SlSMARCE1基因，检测SlSMARCE1基因的干扰效率及斜纹夜蛾幼虫在干扰后的体重及死亡率等生理指标，通过qRT-PCR方法检测SlSMARCE1基因的表达情况。经过前期预实验，对3龄末及4龄初斜纹夜蛾进行dsRNA注射，以确定dsRNA注射的最佳龄期及浓度。对4龄初斜纹夜蛾注射量达20 μg时，并未出现显著的干扰效果。对3龄末斜纹夜蛾幼虫注射32 μg dsSlSMARCE1，结果显示，在干扰后6 h时，已出现有效沉默效果，在24 h时沉默效果达到最佳，其沉默效率为59.05%，但36 h干扰效果出现复苏情况，相比于dsEGFP对照组，该基因的表达均显著降低。其次，注射dsSlSMARCE1基因后，斜纹夜蛾的体重增速慢于对照组（图 4-B，C），这表明沉默后幼虫的生长速度减慢。在胚胎干细胞分化过程中，SMARCE1的缺失导致染色质结构不稳定，阻碍异染色质的形成，进而影响胚胎发育及细胞的正常分化（Kashiwagi et al.，2024）。在卵巢癌研究中，SMARCE1敲低后，可抑制细胞生长，并使细胞周期停滞于G1期（Yamaguchi et al.，2015）。在小鼠模型中，SMARCE1的缺失导致T细胞发育异常，进而影响细胞的正常分化和成熟（Lomeli et al.，2016）。此外，将dsSlSMARCE1喷洒于斜纹夜蛾虫体表面后可显著抑制该基因的表达，影响幼虫存活率，与dsEGFP对照组相比，喷洒后5 d的存活率仅为55.16%（图 5-B），这说明SlSMARCE1在斜纹夜蛾的生长发育过程中发挥着关键作用。最后，喷洒dsSlSMARCE1后RNAi通路关键基因Ago和Dicer的表达显著升高（图 5-A），这可能反映了昆虫体内对RNA干扰信号的响应和放大机制，进一步证实了RNA干扰技术在斜纹夜蛾防治中的可行性和有效性。
综上所述，本研究不仅揭示了斜纹夜蛾SlSMARCE1基因的基本特性及其在昆虫生长发育过程中的重要作用，而且表明利用RNAi技术可以成功沉默SlSMARCE1的表达以控制斜纹夜蛾，并观察到了显著的害虫生长抑制效果。这些发现为开发基于RNA干扰的新型害虫防治策略提供了有力的科学支持，也为在农业害虫防治中减少化学杀虫剂的使用提供了新思路，为农业害虫的可持续治理提供一种更加环保、高效且具有针对性的方法。未来的研究可以进一步深入探索SlSMARCE1基因的具体分子机制以及其在害虫生理过程中的详细作用，同时优化RNA干扰技术的递送系统和应用条件，以期实现更高效的害虫防控效果。
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图 1 SlSMARCE1蛋白与不同昆虫同源蛋白的氨基酸序列比对分析
注：保守结构域HMG（High mobility group box domain）用绿色框表示；黑色背景氨基酸序列一致；深灰色背景氨基酸序列相似性在70%以上；浅灰色背景氨基酸序列在50%以上；比对中使用的氨基酸序列如下：S. l：斜纹夜蛾（XP_022823517.1）；S. f：草地贪夜蛾（XP_050551896.1）；H. a：棉铃虫（XP_063895445.1）；B. m：家蚕（XP_062528045.1）。
Fig. 1 Multiple sequence alignment of SlSMARCE1 with homologous proteins from other insect species
Note: The conserved HMG-box domain was indicated with green box. Amino acids identical in all sequences were shaded in black. Positions with > 70% and > 50% similarity were shaded in dark gray and light gray, respectively. Amino acid sequences used in the alignment were as follows: S. l: Spodoptera litura (XP_022823517.1); S. f: Spodoptera frugiperda (XP_050551896.1); H. a: Helicoverpa armigera (XP_063895445.1); B. m: Bombyx mori (XP_062528045.1).
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图 2 基于SMARCE1氨基酸序列构建斜纹夜蛾与其他昆虫的系统进化树（A）、SlSMARCE1蛋白三维结构（B）及保守结构域预测（C）
Fig. 2 Phylogenetic tree of Spodoptera litura and related insects based on SMARCE1 animo acids sequences (A) and prediction of the three-dimensional structure of SlSMARCE1 protein (B) and the conserved domain (C)
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图 3 斜纹夜蛾SlSMARCE1基因的时空表达分析
注：图中数据表示为三个独立生物学重复的平均值±标准误，误差棒表示标准误。处理组与对照组之间的差异显著性分析采用Student's t-test进行分析，并用星号表示。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。图 4、图 5同。
Fig. 3 Spatiotemporal expression analysis of Spodoptera litura SlSMARCE1 gene
Note: Data were presented as the Mean ± SE of three independent biological replications, and error bars indicated standard errors. Significant differences between treatment groups and control were analyzed by Student's t-test and expressed by the asterisk. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. Same to Fig. 4 and Fig. 5.
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图 4 沉默SlSMARCE1对斜纹夜蛾SlSMARCE1基因表达（A）及幼虫发育（B，C）的影响
Fig. 4 Effect of silencing SlSMARCE1 on the expression of SlSMARCE1 (A) and larval development (B, C) in Spodoptera litura
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图 5 喷洒dsSlSMARCE1对斜纹夜蛾RNAi相关基因表达（A）及死亡率（B）的影响
Fig. 5 Effect of spraying dsSlSMARCE1 on the expression of RNAi-related genes (A) and mortality (B) in Spodoptera litura
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表 1 本研究所用引物列表
Table 1 Primers used in this study
基因Genes 引物序列（5'-3'）Primer sequences 目的Purpose SMARCE1-F ACAACTCGCCCGCGTATTTA PCR扩增及dsRNA合成
PCR Amplification and dsRNA SynthesisSMARCE1-R TGTTCTATCGCTCGCTCCAC SMARCE1-qF CACCACACATCACGTCTCCA RT-qPCR SMARCE1-qR GTAGTAACGTCCGCCGTAGG GAPDH-qF GGGTATTCTTGACTACAC RT-qPCR GAPDH-qR CTGGATGTACTTGATGAG UCCR-qF GCCAAGATTGAGATCAAG RT-qPCR UCCR-qF GCATACTCCGATAACTAC EF1α-qF CGAAACCGCTAAATACTATGTCAC RT-qPCR EF1α-qR AACGGGATTCGCTGTATGG RPL10-qF GACTTGGGTAAGAAGAAG RT-qPCR RPL10-qR GATGACATGGAATGGATG 表 2 PCR扩增体系
Table 2 PCR amplification system
试剂Reagent 体积（μL）Volume PCR反应程序PCR Protocol 2×Hieff® Ultra-Rapid Ⅱ HotStart PCR Master Mix 25 95℃预变性3 min Initial Denaturation: 95℃ for 3 min Nuclease-free water 20 $ 35 \times\left\{\begin{array}{l} 95\text {℃变性15}\mathrm{~s} \text { Denaturation: } 95℃ \text { for } 15 \; \mathrm{sec} \\ 58\text {℃退火20}\mathrm{~s} \text { Annealing: } 58℃ \text { for } 20 \; \mathrm{sec} \\ 72\text {℃延伸1}\mathrm{~kb} / \mathrm{s} \text { Extension: } 72℃ \text { at } 1 \mathrm{~kb} / \mathrm{s} \end{array}\right. $ Forward primer 2 Reverse primer 2 cDNA Template 1 72℃终延伸5 min Final Extension: 72℃ for 5 min Total volume 50 4℃保存Hold: 4℃ -
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