蜜蜂作为生态系统中的优势传粉昆虫，在农作物授粉、维持生态系统稳定和保护生物多样性等方面占据着举足轻重的地位（Iwasaki and Hogendoorn，2021）。不过，近年来发生的蜂群崩溃失调症（Colony collapse disorder，CCD）对全球养蜂业造成严重影响，其特征表现为：蜂群中工蜂突然消失，但蜂群附近极少发现或并无死亡蜜蜂，蜂箱内留有蜂王、卵、幼虫以及部分幼龄工蜂，蜜蜂的健康问题也受到越来越多的关注（Tang et al.，2020）。目前，虽然造成CCD现象发生的具体原因尚不明确，很多研究表明杀虫剂的滥用和大量使用可能是造成蜜蜂蜂群下降的重要原因（Hristov et al.，2021）。

拟除虫菊酯类杀虫剂是天然除虫菊素的人工合成类似物，具有广谱的触杀和胃毒作用，因其高效低毒、低残留、环境兼容性高、持效期久等诸多优点，而被广泛开发利用。然而，其在防控农业害虫的同时，也会对有益昆虫，如重要传粉昆虫蜜蜂的生存和健康产生威胁（刘文斌等，2022）。联苯菊酯是目前使用较广的拟除虫菊酯类杀虫剂之一，作为I型类杀虫剂，其主要通过干扰电位依赖的Na⁺通道闸门开闭，延长受害昆虫神经细胞Na⁺通道的开放时间，使其过度兴奋、惊厥，最后麻痹而死（Gammon et al.，2019）。研究表明联苯菊酯在蜂产品中具有较高的残留量（Tong et al.，2018；Xiao et al.，2022），并对蜜蜂健康造成影响。Dai等（2010）研究发现，亚致死浓度曝露能显著降低西方蜜蜂的繁殖力和成虫羽化率，延长蜜蜂幼虫的发育期。江鹏（2023）对中国18个省市蜂蜡农药残留调查显示，联苯菊酯检出率为65.74%，平均残留量为140.15 µg/kg，且亚致死浓度联苯菊酯（1 500 µg/kg）胁迫显著降低西方蜜蜂卵的孵化率，并损害蜜蜂幼虫和蛹的生存。

有研究表明杀虫剂胁迫会对蜜蜂免疫解毒系统造成影响。Zhao等（2022）研究发现亚致死浓度印楝素曝露显著降低中华蜜蜂抗菌肽基因表达并抑制多酚氧化酶活性。亚致死浓度吡虫啉长期胁迫能够引起蜜蜂P450介导的解毒系统和肠道代谢功能紊乱，进而降低蜜蜂取食量和生存率（Zhu et al.，2020）。肠道菌群在维持宿主健康中扮演着重要的角色。蜜蜂肠道菌群结构相对简单，主要由八大类细菌组成，主要包括放线菌门的Bifidobacterium asteroides，γ-变形菌纲的Gilliamella apicola和Frischella perrara，β-变形菌纲的Snodgrassella alvi，α-变形菌纲的Alpha-1、Alpha-2.1和Alpha-2.2，以及厚壁菌门的Firm-4、Firm-5等（李还原等，2019）。它们在蜜蜂营养代谢、生长发育和免疫调控等方面发挥着重要作用（张晴晴等，2020）。因此，研究杀虫剂对蜜蜂肠道菌群的影响有助于控制杀虫剂用量并更有效的保护蜜蜂。近年来，很多研究探究了杀虫剂与蜜蜂肠道菌群的互作关系（李来等，2022；Jiang et al.，2024）。然而，关于联苯菊酯对蜜蜂免疫解毒能力和肠道菌群影响的研究却鲜有报道。

本文主要研究了联苯菊酯对西方蜜蜂生存、取食、免疫和解毒相关基因表达以及肠道菌群的影响，以期为此类杀虫剂在蜜源植物上的使用提供了一定的指导作用。

1.   材料与方法

1.1   蜜蜂

本研究所用的西方蜜蜂来自安徽农业大学蜂场。选择群势健康强盛并且蜂王产卵能力强的蜂群，试验采样前的2个月利用除螨剂对蜂群进行除螨管理，之后试验过程中蜂群不会接触到任何杀虫剂。从蜂群中提取一张即将出房的封盖子蜂脾，带回实验室在恒温恒湿培养箱（温度35℃，相对湿度60%，微光）中培养24 h后，收集刚羽化的蜜蜂（定义为1日龄）到塑料蜂笼中（15 cm × 10 cm × 8 cm），提供足量的50%糖水和花粉，放在培养箱中适应培养2 d，然后选取3日龄蜜蜂用于后续杀虫剂胁迫试验（李来等，2022）。

1.2   主要试剂与仪器

主要试剂：联苯菊酯原药（德国Dr公司，纯度99.1%），蔗糖AR（aladdin，中国上海），Trizol（天根，中国北京），ReverTra qPCR RT Master Mix gDNA remover Kit（东洋纺，中国上海），Super Real PreMix Plus (SYBR Green)（天根）；主要仪器：微量移液器，NanoDrop2000超微量分光光度计，高速冷冻离心机，博日普通PCR仪，ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR System等。

1.3   杀虫剂处理

根据联苯菊酯在中国大陆地区蜂蜜、蜂粮等中的残留量，选取5 mg/L和0.5 mg/L作为亚致死处理浓度（Xiao et al.，2022）。取50 mg联苯菊酯原药溶于10 mL丙酮中配置成5 000 mg/L母液，然后取适量母液加入50%糖水中使联苯菊酯浓度分别为5 mg/L和0.5 mg/L，丙酮终体积比不超过0.1%，50%糖水中加入等体积的丙酮作为对照。本研究共设置2个处理组和1个对照组，每组5个生物学重复，每重复包含30头蜜蜂。各组蜜蜂提供足量相应联苯菊酯污染或对照糖水，每2 d更换食物，每天记录和统计每组蜜蜂死亡数和取食量并及时清除死蜂，7 d后收集各组活蜂，液氮速冻后，置于超低温冰箱（-80℃）保存备用。

1.4   总RNA提取及反转录反应

取出1.3中保存蜜蜂在冰上进行解剖并获取中肠，每5个中肠作为一组，利用Trizol法提取总RNA。对获得的总RNA进行浓度测定，并将其稀释成500 ng/L，并以此作为模板进行反转录反应：吸取2 μL总RNA于0.2 mL离心管中，放入PCR仪中65℃反应5 min，反应完成后置于冰上速冷1 min；依次加入4 μL 5×RT master-Mix和14 μL ddH₂O，混匀后再次放入PCR仪中，在以下条件进行反应：37℃，15 min；50℃，5 min；98℃，5 min。待温度降到4℃后反应完成获得cDNA；利用ddH₂O对cDNA进行5倍稀释，分装至-20℃保存，用于后续qPCR反应。

1.5   引物设计与合成

利用Oligo 7软件设计目的基因和内参基因上游和下游引物，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列信息见表 1。

1.6   qPCR

利用1.4中获得稀释后的cDNA作为模板进行qPCR反应，检测基因相对表达水平。20 μL反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物（10 μM）0.6 μL，2 × SuperReal PreMix Plus 10 μL，50 × ROX Reference Dye 2 μL，ddH₂O 6.4 μL。反应条件：95℃ 15 min 1×；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40×。反应完成后生成溶解曲线，以RpS5为内参基因，利用2^-ΔCt法计算目的基因的相对表达量（Schmittgen and Livak，2008）。

1.7   16S rDNA测序

取出1.3中保存蜜蜂在冰上进行解剖获取整个肠道，每5个肠道作为一组，提取其总DNA，然后委托杭州联川生物科技股份有限公司利用高通量测序技术对蜜蜂肠道16S rDNA的V3-V4区进行测序和数据分析工作。

1.8   数据分析

所有数据分析均在SPSS 25.0软件中进行，生存曲线使用log-rank Kaplan-Meier生存分析；各组蜜蜂取食量、基因表达变化利用单因素方差分析（ANOVA），并利用Duncan's多重比较进行显著性差异检验；利用GraphPad Prism 8软件进行制图。

2.   结果与分析

2.1   联苯菊酯对西方蜜蜂生存和取食的影响

连续饲喂7 d后，统计联苯菊酯处理组和对照组蜜蜂死亡数，并绘制生存曲线。结果显示，5 mg/L和0.5 mg/L处理组及对照组蜜蜂生存率分别为85%、93%和95%。5 mg/L处理组蜜蜂生存率显著低于对照组（P < 0.5），而0.5 mg/L对蜜蜂生存没有显著影响（图 1）。

图  1  蜜蜂生存曲线

Fig.  1  Honeybee survival curves

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5 mg/L联苯菊酯处理能够显著降低蜜蜂花粉累积取食量（P < 0.5），而不影响糖水累积取食量；0.5 mg/L联苯菊酯处理对糖水和花粉取食量均没有显著影响（图 2）。

图  2  联苯菊酯对蜜蜂糖水和花粉取食量的影响

注：图中数据为平均数±标准误；不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）（Duncan′s多重检验法）。下图同。

Fig.  2  Effects of bifenthrin on syrup and pollen consumption in honeybees

Note: Data were mean ± SE; different lowercase letters indicated significant differences (P < 0.05) (Duncan′s multiple test). The same convention applies to the figures below.

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2.2   联苯菊酯对西方蜜蜂免疫解毒基因表达的影响

本研究利用qPCR技术检测了联苯菊酯处理对西方蜜蜂中肠免疫和解毒相关基因表达的影响。结果显示，5 mg/L联苯菊酯处理组Abaecin、Apidaecin、Defensin、Hymenoptaecin基因表达量显著高于对照组（P < 0.05），Lysozyme和Glucose dehydrogenase基因表达量没有显著变化；0.5 mg/L联苯菊酯处理诱导Apidaecin和Defensin基因上调表达（P < 0.05），抑制Lysozyme基因表达（P < 0.05），而对Abaecin、Glucose dehydrogenase和Hymenoptaecin基因表达没有显著影响（图 3-A）。

图  3  联苯菊酯对蜜蜂免疫（A）和解毒（B）基因表达的影响

注：ABA, Abaecin; API, Apidaecin; LYS, Lysozyme; GLD, Glucose dehydrogenase; DEF, Defensin; HYM, Hymenoptaecin.

Fig.  3  Effects of bifenthrin on immune (A) and detoxification (B) genes expression in honeybees

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解毒基因表达结果显示，5 mg/L联苯菊酯处理组蜜蜂CYP6AS3和CYP6AS10基因的表达量显著低于对照组（P < 0.05），CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP6AS1和CYP6AS4基因表达量没有显著变化；0.5 mg/L联苯菊酯处理显著抑制CYP6AS10基因表达（P < 0.05），而对CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP6AS1、CYP6AS3和CYP6AS4基因表达没有显著影响（图 3-B）。

2.3   联苯菊酯对西方蜜蜂肠道菌群的影响

2.3.1   蜜蜂肠道菌群测序数据分析

利用overlap对原始双端数据进行拼接、质控、嵌合体过滤后，获得1 080 932条有效数据。通过DADA2软件对有效数据进行去噪处理后获取Amplicon Sequence Variant (ASV)特征表和特征序列，共获得ASV数目为2 132个，其中3组蜜蜂肠道共有ASV数目382个，对照组、5 mg/L处理组、0.5 mg/L处理组特有ASV数目分别为504个、441个、377个，联苯菊酯处理组蜜蜂肠道ASV特征值数目均低于对照组（图 4）。

图  4  蜜蜂肠道菌群ASV特征值Venn图

Fig.  4  Venn diagram of ASV in honeybee gut microbiota

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2.3.2   蜜蜂肠道菌群组成及丰度分析

根据ASV特征序列的注释结果和各组样品的ASV丰度，分别在界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）水平中对各组样本蜜蜂的肠道微生物群落进行物种组成分析，基于物种丰度表和物种注释表，选取了门级和属级水平上丰度排名前15的菌种进行分析和展示。

在门级水平上，共有28种菌门被检出，包括有厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteriota、拟杆菌门Bacteroidota、疣微菌门Verrucomicrobiota和蓝藻菌门Cyanobacteria等。其中，厚壁菌门和变形菌门的菌群丰度占比最高，分别为51.45%和45.14%。5 mg/L处理组与对照组相比，厚壁菌门和变形菌门丰度有所下降；0.5 mg/L处理组，厚壁菌门丰度有所上升，而变形菌门丰度则下降。

在属级水平上，乳酸杆菌属Lactobacillus、Bombilactobacillus属、Snodgrassella属、Gilliamella属、Apilactobacillus属、共生菌属Commensalibacter、Frischella属、Bombella属和双歧杆菌属Bifidobacterium等9种细菌为蜜蜂肠道的优势菌属，菌群丰度占比在93.33%以上。其中乳酸杆菌属、Snodgrassella属、Gilliamella属、Frischella属和双歧杆菌属等5种为蜜蜂肠道中的核心菌群，占总菌属的53.98%，并且所有样本中Lactobacillus属的相对丰度最高，占比为21%，其他4个核心菌群的丰度占比也均在2%以上。

图  5  门和属水平蜜蜂肠道菌群相对丰度

Fig.  5  Relative abundance of honeybee gut microbiota at phylum and genus levels

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2.3.3   蜜蜂肠道菌群多样性分析

2.3.3.1   蜜蜂肠道菌群Alpha多样性

蜜蜂肠道菌群Alpha多样性主要由通过Chao1、shannon、Simpson、Goods_coverage等指数来反映。本研究中各组样本goods_coverage指数均达到1，说明样本物种检出率高，测序结果具有真实可靠性（表 2）。Chao1指数主要用来估计群落中所包含的物种数目，而Shannon和Simpson指数则主要用来衡量群落中物种的多样性，Shannon指数越大，Simpson数值越接近1，说明群落中物种的多样性越高。本研究中，0.5 mg/L处理组与对照组相比，以上3各指数均没有显著差异；5 mg/L处理组Shannon和Simpson指数均显著高于对照组，而Chao1指数没有显著变化（表 2），说明高浓度联苯菊酯胁迫诱导蜜蜂肠道菌群丰富度和多样性升高。

2.3.3.2   蜜蜂肠道菌群Beta多样性

本研究利用非度量多维尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）和主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）对蜜蜂肠道菌群Beta多样性进行分析。对照组和0.5 mg/L处理组样品点较为集中，说明样品间差异程度较低，两组间差异不显著；而5 mg/L处理组样品点较为分散，说明样品间差异程度较高，且与对照组相比差异极显著（P < 0.01）（图 6）。

图  6  蜜蜂肠道菌群Beta多样性分析

Fig.  6  Beta diversity analysis of honeybee gut microbiota in different groups

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2.3.4   蜜蜂肠道菌群相对丰度差异分析

对蜜蜂肠道菌群进行LEfSe（LDA Effect Size）检测，分析获得各组间在丰度上具有显著性差异的物种，本研究主要对LDA score大于3.0的显著差异物种进行展示。在门级水平上，5 mg/L处理组和0.5 mg/L处理组拟杆菌门Bacteroidota相对丰度显著低于对照组（P < 0.05）（图 7）。在属级水平上，5 mg/L联苯菊酯胁迫下，共生菌属Commensalibacter和Klebsiella属相对丰显著升高，Apilactobacillus属的相对丰度显著降低（P < 0.05）；0.5 mg/L联苯菊酯胁迫下，肠道核心菌乳杆菌属Lactobacillus相对丰度显著升高，而Bombella属的相对丰度显著降低（P < 0.05）（图 7）。

图  7  蜜蜂肠道菌群LEfSe差异分析

Fig.  7  LEfSe analysis of the honeybee gut microbiota in different groups

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3.   结论与讨论

联苯菊酯是一种常见的拟除虫菊酯类杀虫剂，被广泛用于蜜粉源作物害虫防治，而关于该杀虫剂对重要传粉昆虫蜜蜂健康影响方面研究较少。本研究主要探究了亚致死浓度联苯菊酯长期经口胁迫对西方蜜蜂生存、取食、免疫解毒基因和肠道菌群的影响。结果发现5 mg/L联苯菊酯能够显著降低蜜蜂生存率，而0.5 mg/L联苯菊酯虽然对蜜蜂生存率影响不显著，但随着胁迫时间的延长也呈现生存率下降的趋势。前人研究也发现联苯菊酯暴露剂量和时间与蜜蜂死亡率呈现明显的正相关关系（Qualls et al.，2010），表明蜜蜂长期取食被联苯菊酯污染的食物，会对其生存造成威胁。蜂蜜和花粉是蜜蜂取食的主要重要食物，也是蜜蜂生长发育过程中营养和能量的重要来源（Nicolson，2011）。本研究发现，5 mg/L联苯菊酯胁迫能够抑制蜜蜂取食量，而不影响糖水取食。此前有研究发现菊酯类杀虫剂的趋避作用会造成昆虫取食量降低（Ozawa et al.，1992），这可能是联苯菊酯抑制花粉取食量的重要原因。

抗菌肽是昆虫先天免疫系统重要组成部分，蜜蜂体内抗菌肽主要由Apidaecin、Hymenoptaecin、Defensin和Abaecin四大抗菌肽家族组成。蜜蜂受到外源物质侵害时，抗菌肽基因被迅速诱导表达，产生大量抗菌肽参与清除和抑制细菌、真菌和病原体等，保护蜜蜂免受外来致病物质侵害（Rahnamaeian，2011；Richard et al.，2012）。本研究显示，联苯菊酯胁迫下，蜜蜂4种抗菌肽基因均能诱导上调表达，且5 mg/L处理诱导作用明显强于0.5 mg/L处理，表明随着联苯菊酯浓度的升高由抗菌肽介导的免疫通路被激活以对抗该杀虫剂对蜜蜂的胁迫（李来等，2022）。溶菌酶（Lysozyme）是一种重要的免疫酶，能够通过水解细菌细胞壁肽聚糖多糖成分达到杀菌目的（Callewaert and Michiels，2010），在昆虫细胞免疫过程中发挥重要作用。本研究发现0.5 mg/L联苯菊酯处理能够抑制Lysozyme基因表达，表明联苯菊酯可能会损害蜜蜂细胞免疫过程。

细胞色素P450单氧酶（Cytochrome P450 monooxygenase，CYP）是昆虫体内重要的多功能解毒酶，CYP介导的解毒代谢过程是害虫抗药性形成的重要原因（Yu et al.，2015）。相较于果蝇Drosophila等其他害虫，蜜蜂基因组中解毒酶基因数量较少，这也是蜜蜂对杀虫剂等有毒物质敏感性较高的原因（Claudianos et al.，2006）。研究结果发现，5 mg/L联苯菊酯处理显著抑制CYP6AS3和CYP6AS10基因的表达，0.5 mg/L抑制CYP6AS10表达，表明联苯菊酯曝露能够损害蜜蜂解毒系统，造成蜜蜂死亡。

动物肠道菌群在维持宿主健康中发挥着重要的功能，蜜蜂肠道菌群组成和结构相对简单，主要菌群由八大类细菌组成，占总菌群98%（Martinson et al.，2012；Sabree et al.，2012）。蜜蜂肠道菌群稳态对宿主健康至关重要，若这种稳态被破坏，蜜蜂各种生理会发生紊乱，进而可能会导致蜜蜂死亡（Hooper and Gordon，2001；Crotti et al.，2013）。本研究对联苯菊酯胁迫下西方蜜蜂肠道菌群组成和结构进行了分析，总共获得了28种菌门，其中厚壁菌门（51.45%）和变形菌门（45.14%）占比最高，这与Yun等（2018）研究结果一致，他们也发现这两种菌门丰度以56.65%和42.16%的比列占主导地位。这两种菌门在肠道菌群中相互协调是构成菌群稳态环境的重要保证（Engel and Philipp，2012）。但是，联苯菊酯胁迫显著降低了拟杆菌门的相对丰度。拟杆菌门是一种革兰氏阴性菌，是人类和动物肠道中的主要菌群之一，具有降解复杂聚合物促进宿主食物消化和营养获取的能力，并可以保护肠道细胞形态免受致病菌的损害（Pan et al.，2023）。联苯菊酯胁迫下抑制拟杆菌门生长，可能会破坏蜜蜂肠道菌群稳态平衡，导致蜜蜂消化吸收功能减弱、免疫力下降。

在联苯菊酯胁迫下，本研究发现相对丰度较高且发生显著性变化的菌属主要有乳杆菌属、共生菌属、Apilactobacillus属、Bombella属等。乳杆菌属是蜜蜂肠道优势菌属，不仅参与糖的代谢和转运（Zhang et al.，2018），还具有粘附宿主细胞的能力，促进宿主细胞的持久和定殖，通过各种机制保护粘膜屏障，保护宿主肠道免受病原的侵害（Sengupta et al.，2013）。共生菌属广泛存在于蜂巢、蜂粮和蜜蜂肠道中，全基因组测序分析发现共生菌属类群中含有大量编码合成糖类和维生素的基因簇，促进宿主对营养物质的吸收（Botero et al.，2023）。Apilactobacillus属隶属于乳杆菌科，该菌属不仅可以降解花粉中的有害物质酚酸，降低花粉中有毒物质对蜜蜂的影响，还能释放有益酶为蜜蜂提供营养（Vergalito et al.，2020）。同时，Apilactobacillus属在宿主遇到不良因子胁迫时还具有免疫刺激作用（Matsuzaki et al.，2022）。Bombella属类群基因组中富含编码磷酸戊糖酶和膜结合脱氢酶的基因，在宿主对碳水化合物代谢方面发挥关键作用；此外，该菌属还具有抗真菌活性，保护宿主免受病原真菌侵害（Härer et al.，2022；张维等，2023）。联苯菊酯胁迫下这些重要肠道菌属丰度变化，可能会引起肠道稳态紊乱，导致蜜蜂营养消化吸收、免疫能力等下降。

综上所述，联苯菊酯曝露不仅损害西方蜜蜂生存和取食，并对其免疫解毒系统以及肠道稳态造成影响。研究结果对深入探究联苯菊酯与蜜蜂分子机制上的互相作用以及对肠道菌群的互相作用具有一定生物学的意义。