The pathogenicity difference of Metarhizium rileyi MDXZ200803 and SLSY200714 to the larvae of Spodoptera frugiperda
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摘要:
为了研究莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda幼虫的致病机制，本研究在田间草地贪夜蛾幼虫罹病虫体上分离鉴定了两株莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714。采用浸渍法分别测定5个孢子浓度（1×104~1×108个/mL）的莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄和5龄幼虫的毒力以及侵染后草地贪夜蛾3龄幼虫保护酶（POD、CAT和SOD）和解毒酶（GST和CarE）的变化。研究结果表明，莱氏绿僵菌菌株MDXZ200803侵染草地贪夜蛾3龄幼虫8 d后，1×107个/mL和1×108个/mL孢子浓度的累计校正死亡率均达到100%，对5龄幼虫的累计死亡率都未达到100%。莱氏绿僵菌菌株SLSY200714侵染草地贪夜蛾3龄幼虫8 d后，只有1×108个/mL孢子浓度的累计死亡率达到100%，对5龄幼虫的累计死亡率则均未达到100%。莱氏绿僵菌1×108个/mL孢子悬浮液处理草地贪夜蛾3龄幼虫36 h、48 h、60 h和72 h后，CAT、SOD和CarE的酶活性在处理36 h时最高，随后逐渐下降，而POD和GST酶活性在48 h时最高，之后下降。本研究从宿主免疫酶活性变化角度出发，为揭示莱氏绿僵菌的致病机制提供了一定的理论依据，同时为草地贪夜蛾的绿色防控奠定了基础。
Abstract:In order to study the pathogenic mechanism of Metarhizium rileyi on Spodoptera frugiperda larvae, two strains of M. rileyi MDXZ200803 and SLSY200714 were isolated and identified from the diseased larvae of S. frugiperda in the field. The virulence of M. rileyi under five spore concentrations (1×104~1×108 conidia/mL) to the 3rd and 5th instar larvae of S. frugiperda and the changes of protective enzymes (POD, CAT and SOD) and detoxification enzymes (GST and CarE) in 3rd instar larvae infected by two strains of M. rileyi were determined by the impregnation method. The results showed that the cumulative corrected mortality of the 3rd instar larvae of S. frugiperda was 100% at the concentration of 1×107 conidia/mL and 1×108 conidia/mL after 8 days of infection with the strain MDXZ200803, and the cumulative corrected mortality of the 5th instar larvae did not reach 100%. Eight days after M. rileyi SLSY200714 infected the 3rd instar larvae of S. frugiperda, only the cumulative corrected mortality at the concentration of 1×108 conidia/mL reached 100%, and the cumulative corrected mortality for the 5th instar larvae did not reach 100%. After 3rd instar larvae of S. frugiperda were treated with 1×108 conidia/mL for 36 h, 48 h, 60 h and 72 h, the activities of CAT, SOD and CarE were the highest at 36 h and then decreased gradually, while the activities of POD and GST were the highest at 48 h and then decreased. This study provided a theoretical basis for revealing the pathogenic mechanism of M. rileyi from the perspective of host immune enzyme activity changes, and provides ideas for the biological control against S. frugiperda.
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草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda隶属于鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae（Todd and Poole，1980）；其寄主植物多达76科353种，包括玉米Zea mays、水稻Oryza sativa、小麦Triticum aestivum等三大主粮作物，2019年首次侵入中国云南省普洱市江城县（杨学礼等，2019）。目前该害虫已经严重威胁世界多个国家的农业发展（Montezano et al.，2018）。
化学防治是草地贪夜蛾应急防控的主要措施，但长时间使用会导致草地贪夜蛾抗药性增加，防控难度加大。目前草地贪夜蛾已对有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类化学药剂产生了抗药性（李强等，2021；Gui et al.，2022）。昆虫病原真菌的应用作为害虫生物防治的方法之一，因其对环境友好、易流行、不易产生抗性等特点而被广泛使用（Mahato and Paikaray，2021）。研究调查发现，白僵菌属Beauveria spp.和绿僵菌属Metarhizium spp.这两类虫生真菌不仅对草地贪夜蛾有较好的防治效果，而且对人类健康和环境友好安全。莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi又名莱氏野村菌Nomuraea rileyi，主要侵染鳞翅目夜蛾科的害虫（Fronza et al.，2017），但对低龄幼虫和高龄幼虫的毒力有明显差异（Pang et al.，2023a，2023b）。莱氏绿僵菌不仅对草地贪夜蛾幼虫有较好的防治效果（郑亚强等，2019），也对甜菜夜蛾Spodoptera exigua、斜纹夜蛾Spodoptera litura、棉铃虫Helicoverpa armigera等多种农业害虫有较强的致病力（Grijalba et al.，2018），并在适宜条件下可引起田间害虫种群流行病，是一种具有广阔应用前景的虫生真菌（魏雪菲等，2019）。
莱氏绿僵菌的侵染循环过程主要包括粘附、萌发、穿透体壁、体内增殖和分生孢子再传播。莱氏绿僵菌粘附在昆虫体壁后，分生孢子萌发分化形成附着胞穿透体壁侵入昆虫体内；菌丝进入昆虫血腔后大量增殖，导致虫体内生理和代谢紊乱，最终造成昆虫死亡；昆虫死亡后菌体继续增殖穿出体表，在虫体表面产生大量分生孢子, 借助气流等外力作用, 对其它害虫进行再次感染（Fronza et al.，2017；Wang et al.，2021）。
真菌侵染后，昆虫产生应激响应，体内相关免疫酶的活性会发生显著变化（尹飞等，2016）。这些酶主要包括保护酶类的过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）以及解毒酶类的羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等（蒋晴等，2013）。真菌菌丝侵入昆虫后，会引起虫体内产生一系列包括体内酶活性变化的生理应激反应；之后，随着菌丝的大量繁殖，虫体内保护酶和解毒酶活性迅速下降，引起昆虫的一系列生理病理变化，导致昆虫感病死亡（尹飞等，2016；张珏锋等，2018，韩永强等，2023）。
本研究选用两株毒力相差较大的莱氏绿僵菌菌株，并测定其侵染后草地贪夜蛾3龄幼虫相关保护酶和解毒酶的活性变化，分析各处理组之间是否存在显著差异，以期为揭示莱氏绿僵菌的致病机制提供一定的理论依据，也为草地贪夜蛾幼虫的绿色防控提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株和培养
供试菌株是从弥渡县西庄镇（100°58′N，100°19′E）和石林县蓑衣镇（100°30′N，24°81′E）的草地贪夜蛾罹病虫体中分离纯化得到，并命名为MDXZ200803和SLSY200714。采用平板划线法分离纯化1~2次的MDXZ200803和SLSY200714菌株使用划线法将其接种在SMAY培养基（酵母菌粉10 g，麦芽糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，水1 000 mL）（庞继鑫等，2023）。放于恒温培养箱（温度25℃±1℃，光周期L∶D=16 h∶8 h，光照强度3 000 1x）中进行培养。待充分产孢后，将其放在4℃冰箱中，保存使用。
1.1.2 供试虫源
试验所用草地贪夜蛾是在云南农业大学人工气候室内以新鲜玉米叶片饲养10代以上得到纯化种群，玉米叶片种植于人工气候室。初孵幼虫以新鲜玉米叶饲养至化蛹，羽化后的成虫在养虫笼（长0.5 m ×宽0.5 m ×高0.5 m，纱网120目）中饲喂1%蜂蜜水，并放入盆栽玉米供其产卵。在温度25℃±1℃，相对湿度75%，L∶D=16 h∶8 h的人工气候箱饲养。
1.2 研究方法
1.2.1 供试菌株的鉴定及系统发育学研究
1.2.1.1 供试菌株的形态学鉴定
将生长10 d莱氏绿僵菌分生孢子制成浓度为1×107个/mL的孢子悬浮液，取1 μL点至SMAY和PDA培养基上，7 d后观察并记录其菌落的直径、颜色、形态、质地及边缘形状等（胡飞等，2023）。第5~6天用针尖挑取菌丝于载玻片上，滴加无菌水，在光学显微镜下观察拍照；第10天刮取孢子，加入到适量无菌水中摇匀，于光学显微镜下观察其孢子形态和质地（胡飞等，2023）。
1.2.1.2 供试菌株的分子生物学鉴定
采用CTAB法（庞继鑫等，2023）提取MDXZ200803和SLSY200714两株菌株DNA，以其DNA为模板进行PCR扩增，引物采用ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'- T CCTCCGCTTATTGATATGC'），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取5 μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至生工生物公司（上海）股份有限公司测序。25 μL反应体系为：ITS1和ITS4引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min。把所得序列片段在GenBank数据库中进行Blast比对，筛选出与目的菌株具有较高同源性的多个菌株相应序列。
1.2.1.3 系统发育分析
将rDNA-ITS测序得到的序列片段在NCBI网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），通过BLAST程序进行比对，得到了与目的菌株具有同源性的多个菌株相应序列。下载相似性序列的ITS区域，使用MEGA 7.0软件，通过邻接法（Neighbor-Joining method，NJ）构建系统发育树，进行系统发育分析（庞继鑫等，2023）。
1.2.2 供试菌株对草地贪夜蛾幼虫的室内毒力测定
孢子悬浮液的配制：利用无菌解剖刀刮取充分产孢后的孢子，加入灭菌后的0.05% Tween-80配制成悬浮液。用血球计数板，并通过浓度公式计算确定孢子悬浮浓度，后将其稀释配制成浓度为1×108、1×107、1×106、1×105和1×104个/mL孢子的悬浮液备用（Pang et al.，2023）。
$$ \begin{array}{l} 孢子浓度(个/{\rm{mL}}) = \frac{{\rm{n}}}{{80}} \times 400 \times 10000 \times \\ \;\;\;\;\;\;\;\;稀释倍数({\rm{n}}为80小格内孢子总数) \end{array} $$ 采用浸渍法（Pang et al.，2023）将草地贪夜蛾3龄和5龄幼虫分别浸泡在配制好的不同浓度的孢子悬浮液中10 s后取出，用无菌滤纸吸收试虫体表多余水分，放入12孔的养虫板中（每孔放入一头虫），放入适量的玉米叶供取食，之后将培养板放于光照培养箱（25℃±1℃、相对湿度75%、L∶D=16 h∶8 h）饲养，每24 h（每日的14:00）观察1次，并记录死亡虫体数量和死亡时的虫体形态，初步根据死亡虫体的状态来判断死亡原因。发现死亡的虫体僵硬且弯曲呈“C”形或是表面覆盖有白色菌丝物质的死亡虫体，把死亡虫体取出，移至垫有湿润的无菌滤纸的灭菌培养皿中保湿培养，观察培养皿中死亡虫体表面是否有白色菌丝或绿色的分生孢子长出。挑取虫体表面的分生孢子，鉴定是否为莱氏绿僵菌。以无菌0.05% Tween-80处理为对照，每个处理20头，重复3次，观察8 d。
1.2.3 供试菌株处理后草地贪夜蛾幼虫相关酶活测定
1.2.3.1 粗酶液制备
分别用浓度为1×108个/mL的莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714的孢子悬浮液处理草地贪夜蛾幼虫，将处理后的3龄幼虫加入1 mL生理盐水溶液后研磨为组织匀浆，将组织匀浆于4℃和6 000 r/min离心8 min，取上清液作为粗酶液，以无菌0.05% Tween-80处理为对照，每个处理做3次重复（Pang et al.，2023）。使用南京建成生物BCA蛋白浓度确定试剂盒测定总蛋白浓度，用于最后酶活酶活浓度计算。
1.2.3.2 保护酶和解毒酶活性测定
粗酶液用于测定草地贪夜蛾幼虫保护酶和解毒酶的活性。过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和羧酸酯酶（CarE）的酶活性采用南京建成生物研制的试剂盒进行测定；具体操作参照Pang等（2023）的方法，以无菌0.05% Tween-80处理为对照，每个处理做3次重复。
1.3 数据分析
根据公式计算累计死亡率，采用SPSS 25.0软件进行方差分析和回归分析，求出毒力回归方程，计算致死中时间LT50和致死中浓度LC50；SPSS 25.0进行单因素方差分析，并采用Duncan's进行多重比较。P < 0.05表示两组之间有显著差异，P < 0.01表示两组之间有极显著差异。采用GraphPad Prism 7.0软件作图。
$$ \text { 累计死亡率 }(\%)=\frac{\text { 试虫死亡数 }}{\text { 试虫总数 }} \times 100 $$ 2. 结果与分析
2.1 两株莱氏绿僵菌的形态学鉴定和分子鉴定结果
2.1.1 形态学鉴定结果
将2株菌分别接种至SMAY和PDA培养基上培养7 d后，菌落正面覆有浅绿色的分生孢子粉，质地为绒毛状（图 1-A、C、E、G），菌落背面为淡黄色（图 1-B、D、F、H）。在SMAY培养基上，两株菌菌落边缘不规则（图 1-A、B、E、F）；在PDA培养基上，两株菌菌落边缘规则呈圆形（图 1-C、D、G、H）。在光学显微镜下观察其分生孢子梗直立，呈穗状，其表面光滑（图 1-I、J、L、M）；分生孢子两端较尖，中间较粗，呈椭圆形，表面光滑无刺（图 1-K、N）。其形态初步鉴定符合绿僵菌的特征。
图 1 莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714形态特征注：A和B为莱氏绿僵菌MDXZ200803在SMAY培养基正反面形态特征；C和D为莱氏绿僵菌MDXZ200803在PDA培养基正反面形态特征；E和F为莱氏绿僵菌SLSY200714在SMAY培养基正反面形态特征；G和H为莱氏绿僵菌SLSY200714在PDA培养基正反面形态特征；I、J和K为莱氏绿僵菌MDXZ200803产孢结构以及分生孢子形态；L、M和N为莱氏绿僵菌SLSY200714产孢结构以及分生孢子形态。Fig. 1 Morphological characteristics of Metarhizium rileyi MDXZ200803 and SLSY200714Note: A and B was the morphological characteristics of Metarhizium rileyi MDXZ200803 on the positive and negative sides of SMAY medium, respectively. C and D was the positive and negative morphological characteristics of M. rileyi MDXZ200803 in PDA medium, respectively. E and F was the morphological characteristics of M. rileyi SLSY200714 on the positive and negative sides of SMAY medium, respectively. G and H was the positive and negative morphological characteristics of M. rileyi MDXZ200803 in PDA medium, respectively. I, J and K were the sporulation structure and conidial morphology of M. rileyi SLSY200714; L, M and N were the sporulation structure and conidial morphology of M. rileyi SLSY200714.
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2.1.2 分子生物学鉴定结果
使用PCR扩增目的菌株的ITS-rDNA序列片段，在GenBank数据库中进行Blast比对。供试菌株与数据库中莱氏绿僵菌的同源性在99%以上。结合形态学特征鉴定和分子生物学鉴定结果可知，这两株供试菌株均为莱氏绿僵菌。
2.2 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾幼虫室内毒力的比较
2.2.1 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力测定
莱氏绿僵菌菌株MDXZ200803和SLSY200714处理的草地贪夜蛾3龄幼虫分别在第2天和第3天开始出现死亡现象，在第4天和第5天时死亡数量达到高峰。在第8天时，MDXZ200803浓度为1.0×107个/mL和1.0×108个/mL处理组的所有供试幼虫均死亡，SLSY200714仅1.0×108个/mL处理组的所有供试幼虫均死亡。死亡初期虫身僵硬，虫体弯曲呈“C”状。将僵虫保湿培养后，虫体长出短绒状菌丝，随后菌体在虫体表面产生橄榄绿的分生孢子。
图 2 基于ITS基因序列构建目的菌株与其他绿僵菌的系统发育树（NJ法）Fig. 2 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and other related Metarhizium strains based on ITS region sequence (Neighbour-Joining method)下载:
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根据莱氏绿僵菌菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力随着孢子悬浮液浓度的增加，LT50逐渐缩短。所有浓度孢子悬浮液处理后的幼虫，从第4天开始，其累计死亡率增长速率MDXZ200803明显高于SLSY200714。1.0×107个/mL的菌液处理时，MDXZ200803的累计死亡率在第8天达到100%，而SLSY200714未达到（图 3）。1.0×107个/mL和1.0×108个/mL的菌液处理时，MDXZ200803的LT50均显著少于SLSY200714，分别少了2.86 d和2.36 d。1.0×106个/mL的菌液处理时，MDXZ200803的LT50为5.77 d；但SLSY200714的幼虫的死亡率低于50.0%，无法进行LT50的估算（表 1）。MDXZ200803和SLSY200714的LC50分别为2.17×106和5.35 ×106，后者的LC50约为前者的2倍（表 2）。经比较分析两株供试菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫毒力的有关参数得出，菌株MDXZ200803的毒力高于SLSY200714的毒力。
图 3 两株莱氏绿僵菌对的草地贪夜蛾3龄幼虫8 d累计死亡率注：A，MDXZ200803菌株；B，SLSY200714菌株；CK，0.05% Tween-80。Fig. 3 The 8 days cumulative mortality of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda caused by two strains of Metarhizium rileyiNote: A, MDXZ200803 strain; B, SLSY200714 strain; CK, 0.05% Tween-80.下载:
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表 1 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力（8 d）Table 1 Toxicity of two strains of Metarhizium rileyi to 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda菌株
Strain孢子浓度（conidia/mL）
Conidia concentrations毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中时间（d）
LT50MDXZ200803 1.0×104 Y=-1.01 + 6.10X 0.79 - 1.0×105 Y=-1.05 + 6.24X 0.80 - 1.0×106 Y=-0.33 + 6.23X 0.86 5.77 1.0×107 Y=-1.17 + 9.97X 0.92 4.37 1.0×108 Y=0.25 + 8.65X 0.98 3.62 SLSY200714 1.0×104 Y=-1.27 + 5.54X 0.67 - 1.0×105 Y=-0.99 + 6.09X 0.79 - 1.0×106 Y=-0.31 + 5.85X 0.86 - 1.0×107 Y=-0.57 + 7.08X 0.91 7.23 1.0×108 Y=-1.06 + 9.41X 0.92 5.98 注：式中的Y是几率值，X是时间的对数。“-”表示处理后的草地贪夜蛾3龄幼虫的死亡率在8 d中低于50.0%，无法对LT50进行估算。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of time. The " - " indicated that the final mortality of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda was less than 50.0 % in 8 d, and the LT50 could not be estimated. 表 2 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的LC50（8 d）Table 2 LC50 of two strains of Metarhizium rileyi to 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda菌株
Strain毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中浓度（孢子/mL）
LC50MDXZ200803 Y = 5.17×10-7X + 52.52 0.45 2.17×106 SLSY200714 Y = 6.71×10-7X + 36.09 0.71 5.35×106 注：式中的Y是几率值，X是浓度的对数。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of the concentration. 2.2.2 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾5龄幼虫的毒力测定
莱氏绿僵菌菌株对草地贪夜蛾5龄幼虫的毒力结果表明浓度在1.0×104~1.0×106孢子/mL的防治效果较低或几乎没有防治效果。莱氏绿僵菌处理后，MDXZ200803菌株的孢子悬浮液在浓度为1.0×105~1.0×108孢子/mL的累计死亡率均高于SLSY200714菌株。MDXZ200803的孢子悬浮液在浓度为1.0 ×107孢子/mL时累计死亡率超过50%，而SLSY200714仅在浓度为1.0×108孢子/mL时，5龄幼虫累计死亡率才超过50%。两株菌在8 d内累计死亡率均未达到100%（图 4）。1.0×108孢子/mL的菌液处理时，MDXZ200803的LT50均明显低于SLSY200714，低了1.52 d。1.0×107孢子/mL的菌液处理时，MDXZ200803的LT50为4.83 d；但SLSY200714的幼虫死亡率低于50.0%，无法进行LT50的估算（表 3）。MDXZ200803和SLSY200714的LC50分别为1.61×106孢子/mL和9.14 ×106孢子/mL，后者的LC50约为前者的5.6倍（表 4）。根据LC50和LT50说明莱氏绿僵菌MDXZ200803的毒力强于SLSY200714，这与对3龄幼虫毒力测定的分析结果相一致。
图 4 两株莱氏绿僵菌对的草地贪夜蛾5龄幼虫8 d累计死亡率注：A，MDXZ200803菌株；B，SLSY200714菌株；CK，0.05%Fig. 4 The 8 days cumulative mortality of the 5th instar larvae of Spodoptera frugiperda caused by two strains of Metarhizium rileyiTween-80。Note: A, MDXZ200803 strain; B, SLSY200714 strain; CK, 0.05% Tween-80.下载:
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表 3 两株莱氏绿僵菌对对草地贪夜蛾5龄幼虫的毒力（8 d）Table 3 Toxicity of two strains of Metarhizium rileyi to 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda菌株
Strain孢子浓度（孢子/mL）
Conidia concentrations毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中时间（d）
LT50MDXZ200803 1.0×104 Y=-1.11 + 5.02X 0.65 - 1.0×105 Y=-1.17 + 5.22X 0.66 - 1.0×106 Y=-1.05 + 6.34X 0.79 - 1.0×107 Y=0.95 + 4.94X 0.86 4.83 1.0×108 Y=0.83 + 5.52X 0.91 4.21 SLSY200714 1.0×104 Y=-1.22 + 4.50X 0.52 - 1.0×105 Y=-1.27 + 5.54X 0.67 - 1.0×106 Y=-0.96 + 5.96X 0.78 - 1.0×107 Y=-0.33 + 5.94X 0.86 - 1.0×108 Y=-0.49 + 6.48X 0.89 5.73 注：式中Y是几率值，X则是时间的对数。“-”是表示草地贪夜蛾5龄幼虫的最终死亡率在8 d中累计低于50.0%，无法估算LT50。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of time. The ' - ' indicated that the final mortality of the 5th instar larvae of Spodoptera frugiperda was less than 50.0 % in 8 days, and the LT50 could not be estimated. 表 4 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾5龄幼虫的LC50（8 d）Table 4 LC50 of two strains of Metarhizium rileyi to 5rd instar larvae of Spodoptera frugiperda菌株
strain毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中浓度（孢子/mL）
LC50MDXZ200803 Y = 5.43×10-7X + 22.92 0.67 1.61×106 SLSY200714 Y = 4.85×10-7X + 23.23 0.79 9.14×106 注：式中的Y是几率值，X是浓度的对数。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of the concentration. 2.3 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的酶活性影响
2.3.1 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫3种保护酶的活性影响
两株莱氏绿僵菌侵染草地贪夜蛾后，虫体内的POD均呈先升后降的趋势，SOD和CAT均呈逐渐下降的趋势。经莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714处理的草地贪夜蛾3龄幼虫体内的POD活性在不同的时间段发生较大变化，处理60 h时，与对照组POD活性相比处理组变化不显著。处理36 h、48 h和72 h时，两个处理组间差异不显著，但两个处理组均与对照组POD活性差异极显著（F2, 6=30.984，P=0.001；F2, 6=34.493，P=0.001；F2, 6=122.554，P=0.000）。在48 h达到最大值后，POD活性开始逐渐下降，在72 h降到最低值，分别为15.93 U/mg prot和17.37 U/mg prot，分别为对照组的0.60倍和0.66倍，均极显著低于对照组（F2, 6=122.554，P=0.000）（图 5-A）。
图 5 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫保护酶活性的影响注：A，POD的活性变化；B，SOD的活性变化；C，CAT的活性变化。统计图的柱上标注的小写字母为不同莱氏绿僵菌处理与对照组的保护酶活性差异的显著性（P < 0.05）。Fig. 5 Effects of two strains of Metarhizium rileyi on protective enzyme activities of 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdaNote: A was the change of POD activity; B was the change of SOD activity. C was the change of CAT activity. The lowercase letters marked on the column of the statistical chart are the significance of the difference in detoxification enzyme activity between different Metarhizium rileyi treatments and the control group (P < 0.05).下载:
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SOD活性在36 h时酶活性最高，分别为14.49 U/mg prot和13.63 U/mg prot，分别为对照组的1.39倍和1.31倍；两个处理组间无显著差异，但均极显著高于对照组（F2, 6=42.72，P=0.000）。在36~72 h间，SOD活性逐渐下降，在72 h时酶活性最低，分别为8.27 U/mg prot和9.57 U/mg prot，分别为对照组的0.81倍和0.93倍；两个处理组间差异不显著（F2, 6=3.667，P=0.091）（图 5-B）。
莱氏绿僵菌处理后36~72 h的草地贪夜蛾幼虫体内的CAT活性呈逐渐下降的变化趋势。在36 h时，两个处理组的幼虫体内的CAT活性均达到最大值，分别为22.57 U/mg prot和22.69 U/mg prot，分别为对照组的2.14倍和1.83倍，均极显著高于对照组（F2, 6=221.771，P=0.000）。在36~72 h间两个处理组CAT活性逐渐下降，均在72 h时达到最低值，分别为13.53 U/mg prot和14.51 U/mg prot，分别为对照组幼虫体内CAT活性的1.07倍和1.15倍，SLSY200714处理显著高于对照组（F2, 6=7.336，P=0.024）（图 5-C）。
2.3.2 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫2种解毒酶活性的影响
研究结果显示，莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714处理的草地贪夜蛾3龄幼虫体内同一时间内的GST活性与对照组之间差异显著，且GST活性在处理36~72 h间呈现先升高后下降的趋，对照组GST活性呈缓慢上升的趋势。GST酶活在48 h时达到其最大值，分别为65.95 U/mg prot和62.66 U/mg prot，分别为对照组的1.55倍和1.47倍，均极显著高于对照组（F2, 6=319.285，P=0.000）。之后处理组幼虫体内的GST活性开始逐渐下降，在72 h时达到最低值，最低值分别为39.56 U/mg prot和33.18 U/mg prot，分别为对照组的0.82倍和0.69倍，极显著低于对照组（F2, 6=155.221，P=0.000）（图 6-A）。
图 6 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫解毒酶活性的影响注：A，GST活性变化；B，CarE活性变化。统计图的柱上标注的小写字母为不同莱氏绿僵菌处理与对照组的解毒酶活性差异的显著性（P < 0.05）。Fig. 6 Effects of two strains of Metarhizium rileyi on the activities of detoxification enzymes in the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdaNote: A was the change of GST activity; B was the change of CarE activity. The lowercase letters marked on the column of the statistical chart are the significance of the difference in detoxification enzyme activity between different Metarhizium rileyi treatments and the control group (P < 0.05).下载:
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莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714处理后的虫体内CarE活性均呈逐渐下降的趋势。处理后幼虫体内CarE的活性在36 h时达到最大值，分别为2.27 U/mg prot和1.93 U/mg prot，分别为对照组的1.24倍和1.05倍；MDXZ200803处理极显著高于对照组（F2, 6=39.022，P=0.000）。之后开始逐渐下降，在72 h时出现最低值，分别为0.54 U/mg prot和0.61 U/mg prot，分别为对照组的0.44倍和0.49倍；均极显著低于对照组（F2, 6=361.541，P=0.000）（图 6-B）。
3. 结论与讨论
本研究中两株莱氏绿僵菌菌株MDXZ200803和SLSY200714在高浓度条件下对草地贪夜蛾3龄幼虫的累计死亡率在第8天时均达到100%，对5龄幼虫的累计死亡率均未达到100%。莱氏绿僵菌侵染草地贪夜蛾3龄幼虫36 h后，虫体内CAT和CarE的酶活性达到峰值，随后逐渐下降，而POD和GST酶活性在48 h后出现类似现象。莱氏绿僵菌在侵染草地贪夜蛾幼虫的过程中，其分生孢子会在24 h内萌发并产生侵入钉侵入昆虫体表，然后于48 h内在靶标昆虫体内以菌丝体的形式迅速进行增值，同时穿出体壁，再次进行生殖生长，致使其靶标昆虫死亡变为僵虫（雷妍圆，2021）。据研究表明，绿僵菌侵入昆虫体内之后，会激活昆虫的免疫系统，导致存在于昆虫体内的蛋白质、保护酶和解毒酶的分泌增多，浓度发生改变。在外界有毒物质如化学农药的影响下，昆虫的活性氧自由基失去动态平衡，对虫体产生毒害作用，但昆虫自身的保护酶SOD、POD、CAT在刺激之下会增加分泌量，增强活性，清除体内过多的活性氧自由基，维持体内自由基的动态平衡，减少外界对虫体的危害（Bashan et al.，2009）。本研究对从罹病的草地贪夜蛾幼虫上分离纯化的两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄和5龄幼虫进行室内毒力测定的结果显示，莱氏绿僵菌菌株MDXZ200803毒力强于SLSY200714的毒力，主要表现在前者的LC50和LT50均小于后者（李茂业等，2015）。莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾的毒力会随着其龄期的增长而下降，这与前人研究结果是一致（苏锦尧等，2018；赵娅如，2023）。研究表明，该现象与高龄幼虫体内的解毒酶活性较高有关，同时也与幼虫体壁的结构密切相关。由于低龄幼虫的体壁相对于高龄幼虫的较薄，随着龄期的增加，虫体的生长，蜡质层也增厚，且幼虫体壁存在的蜡质层可抵御真菌的侵入，增加了莱氏绿僵菌孢子的侵入难度，因而导致其毒力降低（代晓彦等，2017）。然而大部分昆虫病原真菌仅对低龄幼虫防控效果好，而对高龄幼虫防效不佳的原因不仅仅与昆虫自身所具备的防御机制有关，也与昆虫病原真菌的侵染机制密切有关（Pang et al.，2023a，2023b）。
本研究中POD活性是先升高后下降的趋势，可能是莱氏绿僵菌菌丝侵入幼虫体壁，其虫菌体在幼虫体内进行繁殖，分泌的毒素超过虫体防御系统的防御上限，使得幼虫体内的免疫系统失调，POD合成受阻（陈学敏等，2020；张琛等，2020）。莱氏绿僵菌处理草地贪夜蛾幼虫体内的SOD活性也发生显著变化，可能是幼虫体内虫菌体的大量增殖，导致OH-的浓度增大，虫体免疫系统合成大量的SOD；随后大量的孢子在虫体内繁殖破坏防御系统，导致SOD活性逐渐下降（蒋晴等，2013；张珏锋等，2018；陈学敏等，2020）。在侵染过后，因为真菌在体内迅速繁殖和其产生的物质刺激了昆虫的免疫系统，所以虫体内合成大量的CAT以催化细胞内过氧化氢的分解，以防止其过氧化；在CAT活性达到最大值后，因后期虫体体内的活性氧平衡被打破，失去正常的生理机能，CAT的合成逐渐减少；因此，CAT的活性逐渐下降直到达到最低值，之后幼虫逐渐死亡（张琛等，2020；李浩等，2021；蔡霓等，2022）。
GST和CarE作为两种昆虫体内重要的解毒酶，在昆虫对内外源有毒物质分解代谢的过程中发挥着不可代替的作用（李长春等，2019）。昆虫体内的GST可以通过与有毒物质发生反应，使得外源有毒物质毒性下降，并对外源有毒物质的可溶性有增强作用，从而帮助机体将有毒物质排出体外（Firidin et al.，2009）。CarE除了把外源有毒物质代谢出体外，还可作为结合蛋白与外源有毒物质结合，阻止其作用于靶标，从而消除或降低外源有毒物质对虫体的毒害作用（Hemingway，2000）。本研究测定的GST酶活性，在48 h时酶活性达到最大值，说明莱氏绿僵菌在昆虫体内产生的毒素或次生代谢物质与GST发生反应，增加GST的分泌以排除和中和更多的有毒物质（张珏锋等，2018；张琛等，2020）。本研究测定的CarE在36 h后酶活性开始逐渐下降，推测草地贪夜蛾幼虫分泌的CarE作为一种结合蛋白与莱氏绿僵菌产生的有毒物质结合，机体也尽可能较多地分泌CarE来与有毒物质结合，从而表现为酶活性升高，36 h后酶活性下降说明莱氏绿僵菌产生的有毒物质破坏了昆虫机体维持的动态平衡，生命活动受到影响，酶活性开始随着处理时间的延长而逐渐下降直到昆虫死亡（张琛等，2020），具体机制还需进一步研究证实。
本研究中，在用浓度为1×108孢子/mL的莱氏绿僵菌侵染草地贪夜蛾3龄幼虫后，SOD、CAT、CarE的活性随着处理时间的增加呈逐渐下降的趋势，POD、GST的酶活性呈先升高后降低的趋势，表明莱氏绿僵菌侵染初期草地贪夜蛾幼虫通过调节自身体内各种保护酶和解毒酶的活性来抵御外界真菌；侵染后期莱氏绿僵菌破坏了草地贪夜蛾防御系统，导致保护酶和解毒酶活性下降（张琛等，2020；李浩等，2021；李德伟等，2023）。在用莱氏绿僵菌菌株MDXZ200803和SLSY200714侵染草地贪夜蛾3龄幼虫并测定其体内保护酶和解毒酶的试验中，MDXZ200803菌株侵染的草地贪夜蛾3龄幼虫体内的保护酶和解毒酶活性在酶活性上升和下降时的速率均高于毒力较低的SLSY200714菌株。这说明MDXZ200803菌株对草地贪夜蛾幼虫体壁的穿透速度更快，对免疫系统的破坏能力更强，进而对虫体机能影响更大。因此，莱氏绿僵菌对昆虫的毒力越强，其对昆虫体内保护酶和解毒酶的影响越大。
本研究从毒力测定和免疫酶活性角度对莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾幼虫的侵染机制展开分析，初步表明了草地贪夜蛾幼虫在不同毒力大小莱氏绿僵菌的侵染下，体内3种保护酶和2种解毒酶的活性变化趋势，揭示了莱氏绿僵菌致病力强弱可能与其侵染后草地贪夜蛾幼虫体内保护酶和解毒酶活变化相关，为探究莱氏绿僵菌的致病机制提供了一定的理论依据，同时为草地贪夜蛾幼虫的绿色防控提供更多的生防真菌资源。
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图 1 莱氏绿僵菌MDXZ200803和SLSY200714形态特征
注：A和B为莱氏绿僵菌MDXZ200803在SMAY培养基正反面形态特征；C和D为莱氏绿僵菌MDXZ200803在PDA培养基正反面形态特征；E和F为莱氏绿僵菌SLSY200714在SMAY培养基正反面形态特征；G和H为莱氏绿僵菌SLSY200714在PDA培养基正反面形态特征；I、J和K为莱氏绿僵菌MDXZ200803产孢结构以及分生孢子形态；L、M和N为莱氏绿僵菌SLSY200714产孢结构以及分生孢子形态。
Fig. 1 Morphological characteristics of Metarhizium rileyi MDXZ200803 and SLSY200714
Note: A and B was the morphological characteristics of Metarhizium rileyi MDXZ200803 on the positive and negative sides of SMAY medium, respectively. C and D was the positive and negative morphological characteristics of M. rileyi MDXZ200803 in PDA medium, respectively. E and F was the morphological characteristics of M. rileyi SLSY200714 on the positive and negative sides of SMAY medium, respectively. G and H was the positive and negative morphological characteristics of M. rileyi MDXZ200803 in PDA medium, respectively. I, J and K were the sporulation structure and conidial morphology of M. rileyi SLSY200714; L, M and N were the sporulation structure and conidial morphology of M. rileyi SLSY200714.
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图 2 基于ITS基因序列构建目的菌株与其他绿僵菌的系统发育树（NJ法）
Fig. 2 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and other related Metarhizium strains based on ITS region sequence (Neighbour-Joining method)
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图 3 两株莱氏绿僵菌对的草地贪夜蛾3龄幼虫8 d累计死亡率
注：A，MDXZ200803菌株；B，SLSY200714菌株；CK，0.05% Tween-80。
Fig. 3 The 8 days cumulative mortality of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda caused by two strains of Metarhizium rileyi
Note: A, MDXZ200803 strain; B, SLSY200714 strain; CK, 0.05% Tween-80.
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图 4 两株莱氏绿僵菌对的草地贪夜蛾5龄幼虫8 d累计死亡率
注：A，MDXZ200803菌株；B，SLSY200714菌株；CK，0.05%
Fig. 4 The 8 days cumulative mortality of the 5th instar larvae of Spodoptera frugiperda caused by two strains of Metarhizium rileyi
Tween-80。Note: A, MDXZ200803 strain; B, SLSY200714 strain; CK, 0.05% Tween-80.
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图 5 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫保护酶活性的影响
注：A，POD的活性变化；B，SOD的活性变化；C，CAT的活性变化。统计图的柱上标注的小写字母为不同莱氏绿僵菌处理与对照组的保护酶活性差异的显著性（P < 0.05）。
Fig. 5 Effects of two strains of Metarhizium rileyi on protective enzyme activities of 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
Note: A was the change of POD activity; B was the change of SOD activity. C was the change of CAT activity. The lowercase letters marked on the column of the statistical chart are the significance of the difference in detoxification enzyme activity between different Metarhizium rileyi treatments and the control group (P < 0.05).
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图 6 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫解毒酶活性的影响
注：A，GST活性变化；B，CarE活性变化。统计图的柱上标注的小写字母为不同莱氏绿僵菌处理与对照组的解毒酶活性差异的显著性（P < 0.05）。
Fig. 6 Effects of two strains of Metarhizium rileyi on the activities of detoxification enzymes in the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
Note: A was the change of GST activity; B was the change of CarE activity. The lowercase letters marked on the column of the statistical chart are the significance of the difference in detoxification enzyme activity between different Metarhizium rileyi treatments and the control group (P < 0.05).
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表 1 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力（8 d）
Table 1 Toxicity of two strains of Metarhizium rileyi to 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
菌株
Strain孢子浓度（conidia/mL）
Conidia concentrations毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中时间（d）
LT50MDXZ200803 1.0×104 Y=-1.01 + 6.10X 0.79 - 1.0×105 Y=-1.05 + 6.24X 0.80 - 1.0×106 Y=-0.33 + 6.23X 0.86 5.77 1.0×107 Y=-1.17 + 9.97X 0.92 4.37 1.0×108 Y=0.25 + 8.65X 0.98 3.62 SLSY200714 1.0×104 Y=-1.27 + 5.54X 0.67 - 1.0×105 Y=-0.99 + 6.09X 0.79 - 1.0×106 Y=-0.31 + 5.85X 0.86 - 1.0×107 Y=-0.57 + 7.08X 0.91 7.23 1.0×108 Y=-1.06 + 9.41X 0.92 5.98 注：式中的Y是几率值，X是时间的对数。“-”表示处理后的草地贪夜蛾3龄幼虫的死亡率在8 d中低于50.0%，无法对LT50进行估算。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of time. The " - " indicated that the final mortality of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda was less than 50.0 % in 8 d, and the LT50 could not be estimated. 表 2 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的LC50（8 d）
Table 2 LC50 of two strains of Metarhizium rileyi to 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
菌株
Strain毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中浓度（孢子/mL）
LC50MDXZ200803 Y = 5.17×10-7X + 52.52 0.45 2.17×106 SLSY200714 Y = 6.71×10-7X + 36.09 0.71 5.35×106 注：式中的Y是几率值，X是浓度的对数。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of the concentration. 表 3 两株莱氏绿僵菌对对草地贪夜蛾5龄幼虫的毒力（8 d）
Table 3 Toxicity of two strains of Metarhizium rileyi to 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
菌株
Strain孢子浓度（孢子/mL）
Conidia concentrations毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中时间（d）
LT50MDXZ200803 1.0×104 Y=-1.11 + 5.02X 0.65 - 1.0×105 Y=-1.17 + 5.22X 0.66 - 1.0×106 Y=-1.05 + 6.34X 0.79 - 1.0×107 Y=0.95 + 4.94X 0.86 4.83 1.0×108 Y=0.83 + 5.52X 0.91 4.21 SLSY200714 1.0×104 Y=-1.22 + 4.50X 0.52 - 1.0×105 Y=-1.27 + 5.54X 0.67 - 1.0×106 Y=-0.96 + 5.96X 0.78 - 1.0×107 Y=-0.33 + 5.94X 0.86 - 1.0×108 Y=-0.49 + 6.48X 0.89 5.73 注：式中Y是几率值，X则是时间的对数。“-”是表示草地贪夜蛾5龄幼虫的最终死亡率在8 d中累计低于50.0%，无法估算LT50。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of time. The ' - ' indicated that the final mortality of the 5th instar larvae of Spodoptera frugiperda was less than 50.0 % in 8 days, and the LT50 could not be estimated. 表 4 两株莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾5龄幼虫的LC50（8 d）
Table 4 LC50 of two strains of Metarhizium rileyi to 5rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
菌株
strain毒力方程
Regression equation相关系数R
Correlation coefficient致死中浓度（孢子/mL）
LC50MDXZ200803 Y = 5.43×10-7X + 22.92 0.67 1.61×106 SLSY200714 Y = 4.85×10-7X + 23.23 0.79 9.14×106 注：式中的Y是几率值，X是浓度的对数。Note: In the formula, Y was the probability value and X was the logarithm of the concentration. -
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