冈田绕眼果蝇Phortica okadai是一种主要分布于我国黄河及长江流域的杂食性有害昆虫，同时它还是我国一种人兽共患病—结膜吸吮线虫Thelazia callipaeda病的主要传播媒介（王增贤等，2003；王增贤等，2005；王红岩等，2010）。因此无论作为农业有害昆虫还是病原媒介昆虫，对冈田绕眼果蝇进行有效的防制都显得十分必要，但因其危害症状隐蔽，物理防治和单次施药的化学防治效果甚微。已有研究表明无论在冈田绕眼果蝇觅食水果还是传播疾病的过程中，嗅觉机制都起到了很大的作用，尤其是其传播疾病的行为基础—喜食宿主动物眼部分泌物而导致的“绕眼”飞行“趋泪行为”（王增贤等，2003）的分子机制和昆虫化学感受器的关系近年来逐渐成为研究热点。

化学感受是一种古老的生物功能，用于感受各种化学信息，如检测食物、病原体、捕食者、同种个体和最优的繁殖环境等。在昆虫中涉及化学感受的基因家族主要有六类，分别是嗅觉受体（Odorant receptors，ORs）、味觉受体（Gustatory receptors，GRs）、离子感受器（Ronotropic receptors，IRs）、感觉神经元膜蛋白（Sensory neuron membrane protein，SNMPs/CD36）、化学感觉蛋白质（Chemosensory proteins，CSPs）以及气味结合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）（李卫华等，2006；任珍珍等，2010；廖成武，2018）。其中气味结合蛋白（OBPs）基因家族作为嗅觉蛋白中一种重要蛋白在昆虫定位寄主的生命过程中发挥着不可替代的作用（王桂荣等，2002；Bentzur et al.，2018；杜亚丽等，2020；Li et al.，2022）。这些基因家族在不同昆虫和其他节肢动物中的多样性与它们所占据的生态位的复杂性之间存在着广泛的联系。已有的研究认为这些基因家族经历了快速的动态进化，基因的扩张和丢失是变异的主要来源，这为适应新环境提供了机会（谷真毓等，2020；吴帆等，2021）。而本研究中的冈田绕眼果蝇其特殊的觅食行为使其与较单一食性的果蝇发生了生态位的分歧。因此其化学感受器如嗅觉器官的进化研究就有着重要意义。但目前关于冈田绕眼果蝇OBPs基因家族的研究还很少。昆虫成虫的主要嗅觉器官为触角和下颚须（De Bruyne et al.，2001；张林雅，2017），其上密布着大量的嗅觉感器，感器淋巴液中分布着大量与嗅觉相关的蛋白。

本研究以拥有特殊觅食行为的冈田绕眼果蝇为对象，基于课题组前期构建的冈田绕眼果蝇触角转录组鉴定了其OBPs基因家族成员。研究结果有助于探讨这些冈田绕眼果蝇OBPs的进化关系和化学感受功能，对PoOBP83a基因进行了克隆分析，为冈田绕眼果蝇的防治提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   供试昆虫

冈田绕眼果蝇于2015年9月在遵义市郊区果园梨园捕获，并用发酵水果（梨）进行饲养和繁殖。饲养条件为：相对湿度75% ± 5%，温度28℃ ± 2℃，光照8 h/d，25~28 d即可完成一代生活史发育（王莉君等，2019；Wang et al.，2022）。

1.1.2   主要仪器和试剂

人工气候培养箱（BIC-400型）购于上海博迅生物有限公司；电泳槽购于北京六一仪器厂；PCR扩增仪、全自动凝胶成像系统以及荧光定量PCR仪购于美国BIO-RAD公司。

RNAiso Plus试剂，cDNA逆转录试剂盒以及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒均购于日本Takara公司；琼脂糖购于北京索莱宝科技有限公司；DNA Maker和PCR Mix购于北京聚合美生物科技有限公司。相关引物的设计及合成委托于重庆擎科生物技术有限公司完成。

1.2   方法

1.2.1   标本收集

选取羽化后混养12 d以上的冈田绕眼果蝇，雌、雄成虫50头为一组，共6组，在体视显微镜下分离出其触角、口器、头部（无触角及口器）、胸部、腹部、翅和足共7个部位组织；选取卵、幼虫、蛹、羽化24 h成虫和羽化12 d成虫5个阶段，用Trizol法分别提取总RNA，以提取的总RNA为模板按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，-20℃保存备用。

1.2.2   OBP家族成员筛选及生物信息学分析OBPs家族鉴定

本研究对冈田绕眼果蝇触角转录组数据进行组装拼接，作为查询和鉴定冈田绕眼果蝇OBPs基因家族成员的数据库。利用从Pfam网站下载的HMM文件与本地构建的冈田绕眼果蝇触角蛋白数据库（来源于转录组文库）比对，经与NCBI-CDD数据库对保守结构域的确认，并手动删除冗余的转录本，保留最长的转录本。根据获得的蛋白序列，通过本地TBLASTN（版本号v2.10.1），设置E-value为1E^-10，比对冈田绕眼果蝇Trinity拼接的转录本，以寻找冈田绕眼果蝇OBPs基因家族；同时，利用“odorant binding protein”和“general odorant binding protein”为关键词从注释数据库中再次筛选PoOBPs家族基因，获得的PoOBPs基因序列与NCBI中NR数据库在线BLAST比对验证，最后将上述两种方法的鉴定结果进行整合。

生物信息学分析：将PoOBPs蛋白序列使用在线软件genome分析其编码蛋白的保守结构域种类，然后使用在线软件MEME对冈田绕眼果蝇的OBPs家族蛋白保守基序（Motif）进行搜索。利用在线软件ExPASy分析PoOBPs基因家族的理化性质，例如MW（kDa）、理论等电点、不稳定性指数等；利用SignalP 4.1进行信号肽的预测（表 1）。

进化分析：从NCBI中下载银额果蝇Drosophila albomicans、暗果蝇Drosophila obscura、地中海实蝇Ceratitis capitata、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、无尾果蝇Drosophila innubila、黑果蝇Drosophila virilis、双尾果蝇Drosophila biarmipes、亚种果蝇Drosophila subobscura、雅库巴果蝇Drosophila yakuba、拟暗果蝇Drosophila pseudoobscura等物种的共13条OBPs蛋白序列，与冈田绕眼果蝇的15条PoOBPs蛋白序列进行多重序列比对，采用MEGA软件中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，选用Jones-Taylor-Thornton（JTT）做矩阵模型，设置自展值Bootstrip为1 000次。

转录组中基因表达分析：从已获得冈田绕眼果蝇转录组下载雌雄果蝇触角及其他组织样本（翅，足等）中OBPs的表达量数据以探究PoOBPs基因在不同组织下的表达模式。所得数据通过TBtools软件绘制基因表达谱。

1.2.3   候选OBPs基因序列验证

将筛选的OBPs中具有完整ORF且存在信号肽的基因作为候选基因，并设计引物对其进行PCR扩增验证。扩增体系（25 µL）：上下游引物各1 µL，2x Utaf PCR Mix 12.5 µL，cDNA 1 µL，ddH₂O 9.5 µL。反应程序如下：94℃ 3 min，94℃ 30 s，59~65℃ 30 s，72℃ 1 min，总共33个循坏；72℃ 5 min。取5 µL PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳验证，其余产物送重庆擎科生物技术有限公司进行测序。

1.2.4   冈田绕眼果蝇OBPs蛋白结构预测

利用Swiss-model在线软件搜索与冈田绕眼果蝇OBPs氨基酸序列相似性大于30%，且模板覆盖率达到95%以上的蛋白结构；然后选择蛋白质氨基酸序列相似性大于30%的已知蛋白的三维结构作为模板，在Swiss-model在线网站上对冈田绕眼果蝇OBPs进行三维结构建模，利用Pymol实现模型的可视化。

1.2.5   冈田绕眼果蝇PoOBP83a基因的表达量分析

利用RT-qPCR检测PoOBP83a基因在冈田绕眼果蝇不同发育阶段以及不同组织的相对表达量，以β-Actin基因来校正PoOBP83a的相对表达量，以逆转录的cDNA为模板，按照RT-qPCR说明书添加反应体系（25 µL）：TB Green Primex Ex TaqΙΙ (2x) 12.5 µL，正反向引物各1 µL，Template (cDNA) 2 µL，RNase-free H₂O 8.5 µL，总体系25 µL。采用Bio-Rad CFX96 RT-qPCR系统进行扩增反应。RT-qPCR的扩增条件为：预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s；退火60℃ 30 s，总共40个循环，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每组包括3个生物学重复以及3个技术重复。所得数据用2^-ΔΔCt方法计算。各部位间及不同发育阶段的相对表达量采用单因素方差分析（ANOVA）分析，雌雄相同部位差异比较则采用t检验，方差齐则采用LSD法，方差不齐采用Dunnett-t法，P＜0.05表示具有统计学意义，利用Graphpad prism 8.3软件作图。

1.2.6   PoOBP83a蛋白的分子对接验证

将课题组前期从发酵梨（3 d）收集到的挥发性化合物以及查阅文献发现的挥发性化合物（Takken and Knols，1999；Verhulst，2009；Carey et al.，2010）（表 2）作为配体与PoOBP83a蛋白进行分子对接验证。首选，使用SAVES 6.0在线软件中ProCheck，Verify-3D和ERRAT 3大模块对PoOBP83a蛋白模型进行分析评价。从Pubchem在线数据库下载配体的分子结构式，利用AutoDuck Tools 1.5.6软件对冈田绕眼果蝇PoOBP83a与配体进行分子对接。使用OpenBabel 2.3.1软件将配体小分子的SDF格式的文件转换为MOL2格式的文件，然后用AutoDock软件对配体小分子进行预处理，最后以PDBQT格式保存文件。随后，使用AutoDock Tools 1.5.6对PoOBP83a蛋白结构进行去H₂O、氢化，进一步导入处理后的配体分子及PoOBP83a蛋白的结构式进行分子对接验证，在AutoDock软件中分析结合自由能。最后，使用Pymol软件对结果进行可视化分析。

2.   结果与分析

2.1   OBP基因家族筛选及生物信息学分析

基于课题组前期构建的冈田绕眼果蝇触角转录组，共鉴定到15个PoOBPs基因，分别命名为PoOBP1-PoOBP15。通过genome在线软件对15个PoOBPs蛋白的氨基酸序列进行保守结构域种类分析，发现所有的PoOBPs均含有PBP-GOBP结构域。理化性质分析结果表示（表 3），PoOBPs基因家族编码序列长度最短的是192 bp的PoOBP10，最长的是588 bp的PoOBP6。利用ExPASy在线软件对蛋白质的理化性质进行了预测：PoOBP10的最小分子量为7.32 kDa，PoOBP6的最大分子量为23.12 kDa；理论等电点在4.57（PoOBP5）到8.09（PoOBP15）之间，不稳定性指数在24.18（PoOBP1）到49.91（PoOBP14）之间；脂溶性指数的最大值为93.16（PoOBP15），最小值为58.59（PoOBP2）；亲水性和疏水性分析结果表明，除PoOBP15外均为亲水性蛋白。经信号肽预测发现其中6个PoOBPs具有信号肽（表 3）。

在NCBI上搜索并下载其他物种的OBPs氨基酸序列，利用MEGA软件的邻接法构建冈田绕眼果蝇OBPs氨基酸序列的进化树（图 1）。进化树结果表明，冈田绕眼果蝇OBP蛋白可分为5类，OBP蛋白家族基因具有较高的同源性，能够分布在5个不同的进化支上。PoOBP3、PoOBP6、PoOBP9、PoOBP11、PoOBP12和PoOBP13聚集为一支，PoOBP4与地中海实蝇OBP99a单独为一支，PoOBP1和PoOBP14聚集为一支，PoOBP5和PoOBP15聚集为一支，PoOBP2、PoOBP7、PoOBP8和PoOBP10聚集为一支。对冈田绕眼果蝇OBPs家族组织特异性表达模式分析（图 2）发现，除PoOBP2、PoOBP6、PoOBP14和PoOBP15外，其余PoOBPs在触角的均有较高的表达量。

图  1  冈田绕眼果蝇OBPs基因家族的系统进化树

Fig.  1  Phylogenetic tree of the Phortica okadai OBPs gene family

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图  2  冈田绕眼果蝇OBPs基因组织表达量热图

注：Fa，雌触角；Fw，雌翅；Fl，雌足；Fm，雌口器；Ma，雄触角；Mw，雄翅；Ml，雄足；Mm，雄口器。

Fig.  2  Heatmap of tissue expression of OBPs genes in Phortica okadai

Note: Fa, Female antennae; Fw, Female wings; Fl, Female legs; Fm, Female mouthparts; Ma, Male antennae; Mw, Male wings; Ml, Male legs; Mm, Male mouthparts.

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2.2   候选OBPs基因的序列验证

将其中具有完整ORF并存在信号肽的PoOBP5、PoOBP7、PoOBP8、PoOBP12、PoOBP14和PoOBP15共6个基因作为候选基因进行序列验证。以冈田绕眼果蝇成虫cDNA为模板进行PCR扩增，成功扩增出了与预期相符的特异性条带，测序结果表明PoOBP7、PoOBP8、PoOBP12和PoOBP15的序列与预期一致（图 3）。

图  3  PoOBPs基因CDS区PCR扩增产物测序结果

Fig.  3  Sequencing results of PCR amplification products in the CDS region in PoOBPs

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2.3   PoOBPs蛋白结构预测

二级结构预测结果表明，PoOBPs的蛋白组成中，α-螺旋、无规则卷曲、β-转角以及延伸链交替出现，没有β-折叠。其中α-螺旋所占比例最大；无规则卷曲所占比例次之，氨基酸残基间氢键的相互作用调节着蛋白质的二级结构；以删除信号肽的PoOBPs氨基酸序列为目的蛋白序列，利用在线软件Swiss-model对PoOBPs蛋白进化模板搜索，结果显示，除PoOBP3、PoOBP5和PoOBP6外，其余PoOBPs均有大于或等于30%的氨基酸序列模板存在。故对除PoOBP3、PoOBP5和PoOBP6外的PoOBPs进行建模（图 4）。经观察，建模所得的PoOBPs三维结构模型中，只有PoOBP1、PoOBP7、PoOBP12、PoOBP14和PoOBP15具有6个α-螺旋，符合OBP的典型结构特征。其中与PoOBP12一致性最高的模板为62.81%的冈比亚按蚊Anopheles gambiae AgamOBP1（2erb.1.A），PoOBP12的6个α-螺旋分别位于Pro13-Thr30（α1）、Glu34-Asp42（α2）、Glu49-Ile62（α3）、Phe73-Thr79（α4）、Arg85-Lys93（α5）和Leu103-Ala117（α6）。

图  4  PoOBPs蛋白三级结构

Fig.  4  Tertiary structure of PoOBPs protein

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结合生物信息学分析及序列验证结果，选择在触角的表达量较高且稳定的PoOBP12作为候选基因，进行BLAST比对查阅文献发现，PoOBP12可能与气味分子的失活有关（Scheuermann et al.，2019）。并将PoOBP12命名为PoOBP83a（GenBank ID：OR666672）。PoOBP83a基因的序列全长为1 218 bp，开放阅读框为501 p，编码166个氨基酸残基，氨基酸序列中存在6个保守半胱氨酸位点，为Classic-C OBP家族。

2.4   冈田绕眼果蝇PoOBP83a基因的表达模式

冈田绕眼果蝇PoOBP83a基因的表达模式（图 5），结果表明PoOBP83a在冈田绕眼果蝇的每个阶段均有表达，但在羽化24 h的雄成虫中表达量显著高于其他阶段且在雌雄成虫间存在差异表达（P＜0.05），而在羽化12 d时，PoOBP83a的表达量有所下降，但在雌雄成虫间无明显差异，其余阶段的表达量无明显差异（P＞0.05）（图 5-A）；PoOBP83a基因在冈田绕眼果蝇触角的表达量显著高于其他部位（P＜0.05）（图 5-B），在雌雄成虫间无明显差异，其次为翅、口器和头部，表达量最低的为足、胸部和腹部，但雌成虫胸部的表达量高于雄成虫（P＜0.05）（图 5-B）。

图  5  PoOBP83a的表达模式

注：A，不同发育阶段；B，不同组织相对表达量（ns，无显著差异；*，P＜0.05；**，P＜0.01）

Fig.  5  Expression patterns of PoOBP83a

Note: A, Different developmental stages; B, Relative expression levels of different tissues (ns, no significant difference; *, P < 0.05;**, P < 0.01).

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2.5   PoOBP83a蛋白与配体小分子的分子对接验证

对PoOBP83a的建模进行评价时发现，ProCheck程序的评价结果中PoOBP83a分别有94.4%、5.6%的氨基酸位于合理区以及比较合适区，代表蛋白模型结构的共价键及键角构象合理；PoOBP83a的ERRAT值远大于50%，为96.3636%，说明所构建的蛋白模型不同原子间的非键相互作用是合理的；PoOBP83a的Verify_3D得分大于0.2的氨基酸有81.82%，说明构建的三维结构中氨基酸残基合理。通过对PoOBP83a的三维结构模型进行多方面评价，证明所构建的模型质量较高，可用于后续的分子对接。

采用分子对接技术预测配体分子与PoOBP83a之间的潜在作用。结合能越小代表结合越稳定，对接结果越好。PoOBP83a与配体的结合能如表 2所示。从表 2可知，PoOBP83a与18种配体的结合能在-5.63~-3.67之间，芳樟醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、月桂酸乙酯和吲哚的结合能均小于-5.0 kcal，属于高结合能挥发物。结果表明，在这5种配体分子中除吲哚的结合位点为His121外，芳樟醇、苯甲酸乙酯、月桂酸乙酯及苯乙醇的结合位点均为Phe123（图 6）。

图  6  PoOBP83a与苯乙醇（A）、苯甲酸乙酯（B）、月桂酸乙酯（C）、芳樟醇（D）和吲哚（E）的分子对接模拟

注：图中紫色为配体分子，橙色为关键氨基酸残基。

Fig.  6  Molecular docking simulations of PoOBP83a with penylethanoll (A), ethyl benzoate (B), ethyl laurate (C), linalool (D), and indole (E)

Note: Ligand molecules were shown in purple, key amino acid residues in orange.

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3.   结论与讨论

基因家族是指来源于同一祖先，通过基因复制产生一个或多个基因而构成的一类基因。OBPs是一个多基因家族，目前已有超100种昆虫的600多种OBPs被鉴定出来（Rihani et al.，2021；吴帆等，2021）。其中昆虫OBPs作为一类多功能蛋白，能作为载体结合和运输配体到嗅觉神经树突末梢，在昆虫的嗅觉反应发挥作用（Pelosi et al.，2017）。本研究对象冈田绕眼果蝇的一种特殊的“绕眼”飞行行为（Wang et al.，2003），正是此行为间接导致了结膜吸吮线虫的传播，但目前关于这种行为底层的分子机制却知之甚少。已知昆虫共有一套相对保守的嗅觉通路：气味物质-受体-触角叶-高级中枢-行为。受体的选择性和敏感性确保上游信息识别的准确性，而神经元的高效活动保证了下游的触角叶或者嗅小球信息整合和分析的及时性。而这其中OBPs发挥关键的作用。因此本研究利用生物信息学方法从冈田绕眼果蝇触角转录组数据库中鉴定出了15个PoOBPs蛋白。目前分子进化系统是研究物种或基因系统发育关系的有效手段, 可以有效测定基因序列亲缘关系，反映出冈田绕眼果蝇OBPs基因家族成员的进化关系，间接推断出冈田绕眼果蝇的分类地位，为鉴别形态学较难区分的近缘关系较近物种提供分子理论依据，为研究冈田绕眼果蝇的进化遗传学及生态位变化提供参考。基于冈田绕眼果蝇OBPs基因家族各基因序列与所选其他果蝇的OBPs基因家族进化关系，PoOBPs蛋白的进化树结果表明，PoOBPs蛋白共分为5个进化支，说明OBP蛋白家族结构较为保守，可能是从同一祖先进化而来，发挥着相同或相似的功能。

OBP家族的典型结构特征具有6个α-螺旋，二级结构主要以α-螺旋及无规则卷曲为主，这与南彦斌等（2023）的研究发现青海草原毛虫Gynaephora qinghaiensis GqinOBPs二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲相一致。蛋白结构预测发现PoOBP5、PoOBP7、PoOBP8、PoOBP12、PoOBP13和PoOBP15具有信号肽且符合OBPs的结构特征。鉴于此，在转录组数据和表达模式的基础上选择上述6个PoOBPs基因进行序列验证，并结合序列验证及生物信息学分析结果，最终选择PoOBP12作为后续实验对象。并根据Blast比对结果将其命名为PoOBP83a。

组织表达模式分析显示PoOBP83a基因在触角中具有特异性表达（图 5-B），这与已有报道的OBPs在触角特异性表达且主要功能为嗅觉识别相符（Robertson et al.，2003；Pelosi et al.，2018；巩雪芳等，2020）。PoOBP83a在幼虫时期表达量较低，刚羽化雄成虫中的表达量高于其他阶段（图 5-A），可能与冈田绕眼果蝇在幼虫时期对食物需求较低有关，而刚羽化雄虫中表达量较高则可能是搜寻配偶行为有关（丰国蕊等，2023）。OBPs是结合及传递气味分子的重要嗅觉蛋白，它调节着昆虫对化学信号的响应。昆虫体内关键OBPs可以筛选出与行为相关的配体（唐浩宇等，2022）。分子对接是一种低成本研究蛋白与配体结合能力的方法，可以直观地显示出蛋白与配体结合的模式（和东风等，2023）。本研究通过分子对接筛选出了与PoOBP83a具有较高结合能的芳樟醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、月桂酸乙酯和吲哚（表 2）。PoOBP83a的α6螺旋C端中有一部分延伸到结合腔内，这5种配体均结合在这上面，包围它的空腔疏水性较好，使受体与配体能紧密的结合。综上，初步推测PoOBP83a可能与冈田绕眼果蝇发挥嗅觉相关功能有关，当然进一步的功能后期还需通过荧光竞争结合实验或者RNAi等对其进行验证。

本研究采用的主要数据为冈田绕眼果蝇的触角转录组数据，推测在触角中其他OBPs基因家族成员不表达或表达量低，导致Trinitiy软件没有拼出相应基因。而且OBP5等基因不完整也可能和RNA提取或者样本取样有关。后续将通过对冈田绕眼果蝇其他组织中OBPs家族的鉴定及表达谱分析，继续筛选出更多候选OBPs基因。冈田绕眼果蝇相较于果蝇、蜜蜂、蚊子等模式昆虫，表现出了较为独特的觅食行为。因此需要进一步对对冈田绕眼果蝇全基因组进行注释研究，需要对其嗅觉机制中的蛋白基因家族、物种分子进行等进行研究，为解释物种分化、特殊觅食行为等提供基础数据和理论基础。