中华蜜蜂Apis cerana cerana简称中蜂，是广泛分布于我国的东方蜜蜂Apis cerana亚种。作为山区丘陵地带人工饲养的主要蜂种之一，其在我国饲养量大约为400万群（徐祖荫和龙立炎，2019），是我国重要的传粉昆虫。中华蜜蜂授粉可以通过增加植物多样性和农作物产量来确保当地生态系统的稳定和养蜂人的收入（Stein et al.，2017）。

蜜蜂成年工蜂的肠道微生物群，主要包含九类细菌，分别是：Snodgrassella alvi、Gilliamella apicola、Lactobacillus Firm-4、Lactobacillus Firm-5、Bifidobacterium、Frischella perrara、巴尔通体菌Bartonella apis、Parasaccharibacter apium和葡糖杆菌Gluconobacter中特定的一个种类群“Alpha 2. 1”，约占总细菌的95%~99.99%。每类细菌由一组相关细菌组成，它们通过蜜蜂之间相互的哺育、清洁等社会性行为传播（Martinson et al.，2012）。最普遍存在的两种革兰氏阴性菌是Snodgrassella alvi和Gilliamella apicola，它们都属于变形菌门Proteobacteria。Snodgrassella alvi属于奈瑟菌科Neisseriaceae，是一种专性微需氧细菌。Gilliamella apicola属Orbacea科，能代谢蜜蜂体内有毒糖类物质。其次存在较多的是革兰氏阳性菌中的厚壁菌门Firmicutes的两个种，Lactobacillus Firm-4和Lactobacillus Firm-5（Babendreier et al.，2007；Martinson et al.，2011)。还有含量通常不太高，但在大多数成年工蜂肠道中也发现了属于放线菌门的Bifidobacterium asteroides（Scardovi et al.，1969；Bottacini et al.，2017）。上述5种细菌构成了蜜蜂肠道的优势菌。除此之外在蜜蜂肠道中发现数量较少的Frischella perrara、Bartonella apis、Parasaccharibacter apium（Martinson et al.，2011；Engel et al.，2013；Corby-Harris et al.，2014；Kešnerová et al.，2016）。蜜蜂的肠道菌群可以帮助宿主降解有毒物质、吸收多糖和提高免疫反应，从而有利于宿主的健康和体质（Wang et al.，2018）。

Gilliamella是蜜蜂肠道中的核心菌属和优势菌属，并占据重要的生态位（Bottacini et al.，2012；Yun et al.，2014；Kwong et al.，2018）。Zhang等人（2022）通过研究ANI和GTDB全基因组序列比对，将Gilliamella属菌种分为27个种。其中，利用体外分离培养和16S rRNA基因序列比对信息，已经鉴定了5种Gilliamella菌种：G. apicola、G. intestini、G. bombicola、G. bombi和G. mensalis（Kwong et al.，2013；Prae et al.，2017)。在蜜蜂肠道内，Gilliamella生长在Snodgrassella alvi的上方，形成致密的生物膜（Zheng et al.，2019）。Gilliamella谱系定位于后肠不同区域，对应于它们利用宿主空间集中的含氮废物的能力的差异，例如G. apis和G. apicola以不同的方式定殖于肠道：G. apis强烈定植于幽门，G. apicola定植在回肠和直肠的其余部分。由于尿素在幽门处最集中，因此这种分布与G. apis和G. apicola菌株利用尿素作为潜在的氮源相一致（Li et al.，2022）。蜜蜂肠道Gilliamella菌在中和食物毒素、营养物质的生物合成以及食物成分消化中发挥作用，其中包括蜜蜂本身无法消化的复杂碳水化合物和糖的发酵（Engel et al.，2012）。果胶和多糖是蜂蜜的重要成分，是蜜蜂的重要食物来源，果胶和其他多糖的消化可以导致不可消化的或有毒的糖的释放，但Gilliamella能够中和和利用这些副产物（Zheng et al.，2016）。同时Gilliamella在多糖代谢和利用糖底物的能力方面表现出多样性（Zhang et al.，2020）。在宿主和Gilliamella的长期协同进化过程中，不同菌株对碳水化合物的消耗效率与其生长发育能力相关。此外，这些菌株还可以降解宿主难以消化的单糖，甚至对宿主有害。即使在同一Gilliamella菌种的不同个体之间，碳水化合物的降解能力也可能不同（Zhang et al.，2022）。研究表明，Gilliamella中的硫肽可能作为细菌与其他微生物和宿主通讯的信号（Zhang et al.，2022）。不同蜂种的Gilliamella编码的基因也大不相同。对Gilliamella菌株的比较基因组分析表明，熊蜂Gilliamella菌株的半乳糖和果胶消化途径是保守的，而利用阿拉伯糖、甘露糖、木糖和鼠李糖的基因大部分丢失（Zhang et al.，2020）。蜜蜂的Gilliamella菌株比熊蜂相关菌株含有更多使用各种糖的基因，但它们的Gilliamella菌株都保存着编码果胶降解酶的基因（Zhang et al.，2020）。

目前对于Gilliamella属的研究大多数集中在Gilliamella属菌株的分离、分离菌株的进化地位和基因功能注释分析等，而对Gilliamella属分离菌株进行基因组水平的比较分析仍然存在很大不足。在本研究中，首次从中蜂工蜂肠道菌中分离、鉴定得到一株Gilliamella菌株——Gilliamella sp. G0441。然后，结合已经发表的Gilliamella属基因组和Frischella属基因组，通过比较基因组分析明确了该菌株的分类地位，并通过基因注释和基因组高级注释对该菌株的GO、COG、KEEP功能分类注释，并对该菌株的毒力因子、耐药功能、碳水化合物活性酶、病原宿主互作用等进行分析。

1.   材料与方法

1.1   培养基制备

含有5% v/v去纤维蛋白绵羊血的胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）制备方法为：取20 g胰酪大豆胨琼脂培养基干粉（TSA，Difco BD)，溶于500 mL无菌水，高压蒸汽灭菌121℃，20 min，待温度降至55℃时，加入25 mL无菌去纤维蛋白绵羊血（鑫泉科技）摇匀后倒平板。

1.2   中蜂工蜂采集

从广东省科学院动物研究所实验蜂场选择健康强群，用软镊子随机采集10头工蜂于试管中。放入4℃的冰箱中麻醉10~15 min。

1.3   菌株分离与纯化

使用75%酒精浸泡工蜂表面1 min，再用无菌水冲洗后，用灭菌滤纸滤干多余水分。在超净工作台中，无菌解剖剪剪去头部，再用无菌镊子夹住工蜂尾部末端，轻拉出整个肠道（包括蜜囊、前肠、中肠、后肠）到灭菌的小管中，汇集10头肠道于同一管，加入无菌1 mL 1×PBS研磨混匀，并用漩涡振荡器震荡1 min，形成的悬浊液用1×PBS溶液依次稀释10³、10⁴、10⁵三个浓度，各取稀释液100 μL分别涂在TSA培养基上（含5%去纤维蛋白羊血），每个浓度做3个重复。涂布的平板封上封口膜放入厌氧培养箱中，在35℃，RH60%条件下培养3 d。挑取圆形、光滑、半透明的菌落进行纯化，使用平板划线法进行3轮纯化后得到纯菌株。

1.4   菌株保藏

配制20%甘油：取4 mL 100%甘油，然后与16 mL双蒸水混合均匀，放置于高压灭菌锅121℃灭菌1 h，最后分装于1.5 mL离心管中。用接种环小心挑取已纯化的单菌株放入装有20%甘油的1.5 mL离心管中，用封口膜封住离心管管口防止污染，最后将菌株放到-80℃进行保存。

1.5   菌株鉴定

从平板上挑取已纯化的菌落进行PCR扩增。使用细菌通用引物（27F，5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rRNA基因进行鉴定。PCR扩增反应体系为：2 × Taq HiFi PCR mixenzymes 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板10 μL，去离子水13 μL。PCR程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。扩增循环数为35，72℃保持10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。将目的条带切胶回收后送去双向测序。对测序所得核酸序列在NCBI数据库中进行比对、鉴定。

1.6   菌株扩培

对纯化后的G0441菌株进行扩培。将保藏的G0441菌液用无菌水稀释10³倍，取稀释液用100 μL分别涂在TSA培养基上（含5%去纤维蛋白羊血），然后放置在35℃，60% RH的厌氧培养箱中培养7 d。

1.7   细菌框架图测序

1.7.1   DNA质检

小心刮取平板上的菌落。转移适量细菌菌落至离心管中。10 000 g离心1~3 min收集细菌菌体，使用适量的1×PBS溶液进行清洗，初步去除杂质干扰。加入180 μL Buffer STE Plus，30 μL Lysozyme和5 μL RNase A至细菌沉淀团中。

涡旋重悬细菌，室温静置10~20 min。加入200 mg磁珠至样品中，高速涡旋混匀5~10 min进一步裂解细菌，静置1 min，转移溶液至新的离心管中。10 000 g离心1 min收集管壁上的液滴，加入500 μL Buffer BD，震荡混匀，室温放置2 min。2 mL离心管放置在磁力架上吸附5 min，小心吸弃上层清液，并且移开。加入600 μL Buffer AW1，震荡混匀。放置在磁力架5 min，弃上清。加入600 μL 80% ethanol，混匀磁珠。放置在磁力架5 min，弃上清。并重复上述操作一次。快速离心，磁力架吸附后，使用移液器尽可能多的吸取离心管中液体。将2 mL离心管放在55℃烘干，使残留酒精完全挥发。加入50 μL Elution Buffer到离心管中，充分震荡混匀，65℃金属浴10 min。磁力架吸附5 min，小心吸取上清DNA液体到新的1.5 mL离心管中。使用1%琼脂糖凝胶（200 V，30 min）检测DNA完整性，Qubit定量检测DNA样本浓度。

1.7.2   基因组DNA文库构建和测序

利用Qubit^TM dsDNA HS Assay Kit对基因组浓度精确定量，以确定文库构建所加入的DNA总量。制备插入片段长度为500 bp左右的文库，初始DNA总量约为500 ng。使用Elution Buffer将DNA稀释到130 μL，装入0.5 mL的Covaris DNA破碎管中。使用Covaris仪器，按照S220操作参数进行片段化。

首先对DNA片段进行末端修复（末端补平和3'端加A尾），再连接接头，然后磁珠分选纯化连接产物，接着进行文库扩增和文库纯化。

通过2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小。文库浓度测定：为了得到均匀的长簇效果和高质量的测序数据，使用Thermo Qubit 4.0荧光定量仪进行文库浓度测定。在Sangon Biotech（中国上海）的Illumina NovaSeq平台上对合格文库进行测序。

1.8   基因组拼接和生物信息学分析

1.8.1   数据评估及质控

对测序的原始数据通过Fastp进行数据统计以及质量评估，同时进行质量剪切，得到相对准确的有效数据。

1.8.2   基因组拼接

使用SPAdes（Anton et al.，2012）拼接二代测序数据。采用GapFiller（Marten and Walter, 2012）对拼接得到的contig补GAP。利用Pilon进行序列矫正，修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失，最后完成基因组拼接（Table S2）。

1.8.3   基因组分分析

使用NCBI-PGAP（Zhao et al.，2012）/Prokka（Torsten，2014）软件预测基因元件CDS、tRNA、rRNA等。采用Repeat Masker鉴定基因组上的重复序列。利用CRT（Bland et al.，2007）进行CRISPR预测分析。

1.8.4   基因注释

采用NCBI Blast+（Altschul et al.，1997）将基因蛋白序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多个数据库进行比对，得到其功能注释信息。根据基因与Swissprot、TrEMBL的注释结果得到GO功能注释信息。利用KAAS（Moriya et al.，2007）得到基因KEGG注释信息。

1.8.5   基因组高级注释

采用NCBI Blast+（Altschul et al.，1997）将基因蛋白序列与VFDB、CARD、PHI-base等多个数据库进行比对，得到其功能注释信息。采用HMMER3（Eddy，2009）将基因蛋白序列与CAZy数据库进行比对，得到其功能注释信息。利用TMHMM（Steffen et al.，2001）进行跨膜蛋白预测分析，Signal P（Petersen et al.，2011）进行信号肽预测分析，Lipo P进行脂蛋白预测分析。利用Prot Camp进行蛋白亚细胞定位分析，Island Path-DIOMB（Hsiao et al.，2003）进行基因组岛预测分析，Phi Spy（Akhter et al.，2012）进行前噬菌体预测分析。

1.8.6   比较基因组分析

采用NCBI Blast+（Altschul et al.，1997）将拼接得到的基因组与nt库进行比对，根据匹配得分得到其同源菌株信息，整理并收集30个具有完整注释的参考代表性菌株，用于后续分析。收集所有菌株的16S rRNA序列，多重序列比对，并构建系统进化树。利用Roary根据同源菌株基因信息进行泛基因组分析和同源基因簇分析，并根据同源基因构建系统进化树。使用snippy进行突变检测，并根据突变SNP信息构建系统发育树。

2.   结果与分析

2.1   G0441菌株分离、纯化与鉴定

经过三轮纯化后的G0441菌株菌落为圆形，直径1 mm，表面光滑、半透明（图 1-A）。琼脂糖凝胶电泳图显示：G0441菌株的细菌通用引物扩增产物在1 500 bp左右有明显清晰的条带（图 1-B）。对扩增产物进行测序分析知，PCR扩增片段长度为1 448 bp。此外，序列比对结果显示G0441菌株与Gilliamella sp. ESL0441菌相似度最高为99.58%，因此，初步将G0441鉴定为一种Gilliamella菌株。

图  1  G0441菌株分离与鉴定

注：A，G0441菌株平板培养和分离纯化；B，G0441菌株细菌通用引物扩增产物电泳分析。

Fig.  1  Isolation and identification of G0441 strain

Note: A, Plate culture, isolation and purification of G0441 strain; B, Electrophoretic analysis of the amplification products of universal primers from G0441 strain.

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2.2   基因组组装、基因预测及其功能注释

基因组调查（Genome survey）结果显示：G0441基因组纯合度为100%，单倍体基因组长度约为2.56 Mb，其中，重复序列占比约为3.4%，非重复序列占比约为96.6%。实际基因组组装结果为：G0441基因组大小为2.6 Mb，其中，拼接序列平均长度为52 Kb，单条序列最大长度为500 Kb，Contig数目为50个，N50值为185 Kb，序列总GC含量比值为35%。从G0441基因组中一共预测得到2 350个基因，其中包括2 299个蛋白编码基因、5个rRNA基因、45个tRNA基因、1个ncRNA编码基因。蛋白编码基因序列长度占比为85%。此外，还发现4条CRISPR区域序列。G0441基因组全长序列已上传至NCBI GenBank（登录号：PRJNA1195151）。

利用NR、NT、CDD、KOG、COG、PFAM、Swissprot、TrEMBL、GO和KEGG等多个数据库对上述蛋白编码基因进行功能注释，在至少1个数据库注释成功的基因数目占总基因数的比例为99.01%。COG功能分类注释结果显示：氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢、翻译-核糖体结构与生物发生、转录、复制-重组-修复、细胞壁/细胞膜/包膜生物发生等COG功能类别得到显著富集（图 2）。GO注释结果表明：细胞过程、代谢过程及对刺激的反应等生物学过程，膜、含蛋白复合体等细胞组分，结合、催化活性等分子功能，是显著富集的GO条目（图 3）。KEGG注释结果揭示：显著富集的通路多数为代谢相关通路，如碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢通路等，还有膜运输通路也显著富集（图 4）。此外，通过与VFDB数据库进行比对，发现了159个毒力因子（Table S1）；通过与CARD数据库进行比对，得到77个耐药基因（Table S2）；通过与CAZy数据库进行比对，鉴定出22个碳水化合物活性酶，这些酶参与催化碳水化合物降解、修饰、以及生物合成（Table S3）；通过与TCDB数据库进行比对，发现了255种转运蛋白（Table S4）。另外，还注释得到565个跨膜蛋白基因（Table S5），201个信号肽蛋白基因（Table S6）。对脂蛋白进行注释发现1 694个CYT型脂蛋白，195个SpI型脂蛋白，101个SpII型脂蛋白和309个TMH型脂蛋白（Table S7）。

图  2  G0441基因的COG功能分类注释

Fig.  2  COG functional classification annotation of G0441 genes

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图  3  G0441基因GO功能分类注释

Fig.  3  GO function classification annotation of G0441 genes

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图  4  G0441基因KEGG功能分类注释

Fig.  4  KEGG functional classification annotation of G0441 genes

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2.3   泛基因组分析和系统发育树

泛基因组分析结果显示G0441有6种近缘菌株：Gilliamella apicola wkB1（GCA_000599985.1）、Frischella perrara PEB0191（GCA_000807275.1）、Gilliamella sp ESL0443（GCA_019469165.1）、Gilliamella sp ESL0441（GCA_019469185.1）、Gilliamella sp ESL0405（GCA_019469205.1）和Gilliamella sp B3022（GCA_028751545.1）（图 5）。在6种近缘菌株的同源基因中，存在145个共有基因（core gene）和7 190个特有基因（specific gene），其中，G0441含有221个特有基因（图 5）。分别基于core单拷贝基因和全基因组SNP位点的系统进化树分析均表明：G0441与Gilliamella sp. ESL0441菌株亲缘关系最为接近（图 6和图 7）。

图  5  同源基因花瓣图

注：花心表示所有菌株都有的ortholog cluster（即共有基因core gene），花瓣表示每个菌株特有的ortholog cluster（即特有基因specific gene）。

Fig.  5  Petal map of homologous genes

Note: The flower center represented the ortholog cluster shared by all strains (common core gene), and the petal represented the ortholog cluster unique to each strain (specific gene).

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图  6  基于core单拷贝基因的系统进化树

注：以Neighbor-joining聚类的方式，构建系统进化树。

Fig.  6  Phylogenetic tree based on core single copy genes

Note: The phylogenetic tree was constructed by Neighbor-joining clustering method.

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图  7  基于全基因组SNP位点的系统进化树

注：以Neighbor-joining聚类的方式构建系统进化树。

Fig.  7  Phylogenetic tree based on whole genome SNPs

Note: The phylogenetic tree was constructed using Neighbor-joining clustering.

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3.   结论与讨论

在蜜蜂肠道内，Gilliamella生长在Snodgrassella alvi的上方，这是两种菌株的生长特点，但是在菌株实际分离和纯化的过程中，可以从菌株生长条件和菌株特点把这两种菌株区分开来。根据文献（Kwong and Moran，2013）描述，S. alvi是微嗜氧物种，在5% CO₂的条件下获得最适生长，而在空气中或厌氧条件下无生长或生长非常弱，而实验室分离的Gilliamella sp. G0441是在完全厌氧的条件下分离的，两者的培养条件不一样，完全厌氧条件能很大程度上阻止了S. alvi的生长。其次，S. alvi在平板上生长2 d后形成光滑、白色、圆形，直径约1 mm的菌落。而Gilliamella sp. G0441在平板上生长2 d后形成光滑、半透明、圆形，直径约1 mm的菌落。因此，两种菌株的颜色不一样，肉眼便可区分开来。在实验过程中，经过2~3轮纯化之后，形成的菌落都是光滑、半透明、圆形，直径约1 mm的菌落，没有发现符合Snodgrassella alvi特征的菌落。

随着高通量测序技术的发展，DNA序列分析已成为细菌分类领域不可或缺的一部分。基于16S rRNA基因，已经确定了我们分离到的G0441菌株跟Gilliamella sp. ESL0441（Ellegaard et al.，2020）的亲缘关系最近，两菌株的序列相似度Identities为99.86%。对G0441菌株进行比较基因组分析，在菌株水平上G0441有145个核心基因，2 983个附属基因和7 190个特有基因。从同源基因cluster花瓣图也可以看出，G0441与Gilliamella sp. ESL0441和Frischella perrara PEB019等菌株共有的orthologs cluster数目为145，G0441特有的orthologs cluster数目221，以上数据也能够说明G0441与Gilliamella sp. ESL0441不是同一株菌株。

对G0441菌株进行基因注释和基因组高级注释，可以知道G0441在功能预测、氨基酸转运与代谢、生物过程、有机系统等功能上的基因占比最高，说明这几个功能可能是宿主驱动选择的结果。另外在COG功能分类注释和KEGG功能分类注释中，可以看到碳水化合物运输和代谢、碳水化合物代谢注释到的基因数目较多，这些结果一方面与之前的研究结果一致，即Gilliamella是降解花蜜和花粉中所含碳水化合物的主要细菌，来自相同和不同宿主物种的菌株降解碳水化合物的能力不同（Zheng et al.，2019）。

G0441菌株含有T6SS毒力因子，对应1个效应基因。研究表明许多蜜蜂肠道细菌携带编码高度保守的T6SS的基因，这些基因在与蜜蜂宿主结合时就存在，并被大多数但不是全部菌株保留。T6SS损失与宿主和细菌形态有关。研究发现细菌物种采用不同的毒素获取和多样化机制，并且物种和菌株有时会完全失去T6SS，这可能导致这些菌群内竞争动态的变化（Steele and Moran，2021）。T6SS介导的拮抗作用对于蜜蜂肠道中的种内竞争可能很重要，在蜜蜂肠道中，相同物种的菌株竞争主导生态位（Kwong and Engel，2014），并且也可能在种间竞争中发挥作用。因此，T6SS在共同进化菌群之间介导的竞争可能会影响蜜蜂肠道菌群的结构和组成（Russell et al.，2014；Coyne et al.，2016）。

G0441菌株耐药的抗生素种类中四环素抗生素和大环内酯类抗生素占比很高。四环素和泰乐菌素（大环内酯类抗生素）在几个国家的养蜂业中普遍使用，抗生素治疗会影响健康蜜蜂宿主的典型肠道微生物群（Nogrado et al.，2019）。所以并不适合用四环素抗生素和大环内酯类抗生素治疗G0441菌株引起的耐药性。

G0441菌株有糖苷水解酶这种碳水化合物活性酶。研究表明在乳酸菌中发现的许多酶，例如纤维素酶、半纤维素酶和糖苷水解酶，可以让蜜蜂更好地利用饮食中的能量（Lee et al.，2015；Lee et al.，2018）。G0441菌株也有糖苷水解酶，所以可以推测这株菌株有利于蜜蜂更好的利用饮食中的能量。

转运蛋白在营养物质摄取、代谢产物释放以及信号转导等广泛的细胞活动中起着重要的作用。转运蛋白功能注释显示G0441菌株共有255个转运蛋白，其中含有ABC转运蛋白84个。先前的研究表明，ABC转运蛋白在细菌生物膜的形成中起重要作用（Vanderlinde et al.，2010；Powell et al.，2016）。可以推测，生物膜的形成可能涉及生态位分化和适应从G0441菌株通过基因的变化对齐ABC转运体。

G0441菌株有556个跨膜蛋白，占总蛋白的24.58%，之前的研究已经表明跨膜蛋白在机体的生长、代谢和免疫应答机制中具有很重要的调控功能（宋寒宾等，2021）。另外跨膜蛋白与细胞增殖、激活、迁移等多种功能相关，在寄生虫生长发育中起到受体或激素的作用（吴万军等，2015）。这可能提示这些跨膜蛋白有助于G0441菌株在宿主生长、代谢和免疫应答机制中发挥着重要的调控功能。

G0441菌株的脂蛋白中，胞浆蛋白的占比最高。先前的研究表明胞浆蛋白缺失会造成WAS（一种通过X染色体传递的性联遗传性疾病）、低CD8和NK细胞等原发性免疫缺陷病（黄海等，1998），这可能提示G0441菌株在治疗原发性免疫缺陷病可以发挥作用。

本研究利用细菌框架图技术建立了G0441菌株的数据库，获得了大量的序列信息，对表达的基因进行拼接与分析，与公共数据库的基因与蛋白序列比对，进行相应的基因注释、基因组高级注释和比较基因组分析。该细菌框架图数据为今后更加深入研究G0441菌株提供了大量的信息资源，也为以后我们研究蜜蜂肠道微生物Gilliamella属提供参考。