烟草是我国一种重要的栽培经济农作物，能分泌多种生物碱，包括烟碱、降烟碱、新烟碱和假木贼碱，烟碱约占总生物碱的94%以上（Passananti et al.，2014）。烟碱（Nicotine）具有独特的作用，烟碱协助烟草抵御各种害虫的入侵，也是烟草质量评价的重要指标。一般来讲，烟碱含量高的烟叶，烟气劲头越大，反之越小。因此，烟气中必须含有一定量的烟碱，但是烟碱含量也不能过高，否则会增加烟气的刺激性，影响卷烟吸味（Brown et al.，1972；张豪洋等，2021）。目前尽管我国烟叶外观质量已接近国际水平，但是突出的问题就是烟碱含量偏高。美国烤烟的烟碱含量在1.5%~3.5%之间，白肋烟的烟碱含量约2.9%。我国上部烤烟烟碱含量达为3%~4%，白肋烟烟碱含量高达6.0%（Passananti et al.，2014）。烟叶中烟碱含量的阈值在2.0%左右，此时烟叶的内在化学成分最佳，品质最好（Wei et al.，2014；Valentine et al.，2018）。我国每年因为烟叶中烟碱含量太高而造成大量烟叶内积，既浪费了资源，又给烟草行业造成很大经济损失（Brown et al.，1972；万虎等，2009；Passananti et al.，2014）。降低烟叶的烟碱含量是我国烟草行业亟待解决的问题之一。对推动我国烟草行业绿色、低碳和可持续发展具有重要意义。

利用微生物来处理烟叶，既可以提高烟叶资源的利用率，降低卷烟烟碱含量，提高对人类的安全性，又可以减少烟碱对环境的污染。开展这方面的研究具有显著的经济效益和社会效益并获得国内外很多学者的关注。到目前为止，微生物烟碱降解菌被陆续分离，主要包括细菌、真菌和放射菌。细菌主要有（1）假单胞菌属Pseudomonas sp.；（2）节杆菌属Arthrobacter sp.；（3）农杆菌属Agrobacterium sp.；（4）红球菌属Rhodococcus sp.；（5）申氏杆菌属Shinella sp.；（6）不动杆菌属Acinetobacter sp.；（7）鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.；（8）极小单胞菌属Pusillimonas sp.；（9）类诺卡氏菌属Nocardioides sp.；（10）苍白杆菌属Ochrobactrum sp.（Wang et al.，2009；Wei et al.，2014；Valentine et al.，2018）。早在1955年，Frankenburg等（1955）从烟草种子表面分离获得降解烟碱的微生物；Brown等（1984）分离获得假单胞杆菌，并对烟草中的烟碱进行降解。处理18 h后，烟碱含量平均从2.00%降到了0.85%，每支卷烟的烟碱含量从1.58 mg降到了0.98 mg。国内学者也陆续报道，大部分只报道了菌株的分离、鉴定和室内降解效果。李雪梅等（2005）分离Bacillus sp. X6菌株，培养36 h将烟碱含量为6.04 mg/g烟草物料中的烟碱降解60.3%，72 h降解率为87.6%；李颖等（2006）从烟区的土壤中分离获得降解菌中间苍白杆菌；Wang等（2009）获得农杆菌Agrobacterium sp. strain S33；张娟等（2012）和阮爱东等（2015）分离到假单胞菌，均拥有较高降解烟碱能力。因此，为了获得新的高效烟碱降解菌种质资源、研究其降解特性，阐明其代谢途径对于降低烟草上部烟叶烟碱含量具有重要的意义。本研究从湖南省永州市烟草生产技术中心烟草地筛选后获得优良降解烟碱菌株Pu17，并对其分类地位进行鉴定，探究其烟碱降解特性，研究其对不同培养基中烟碱的降解效率和对烟草植株的烟碱降解能力，旨在为微生物资源的开发与应用提供技术指导。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

土壤样品采自湖南省永州市烟草生产技术中心，所有采集样品均放入无菌自封袋中带回实验室于4℃保存备用。烟碱降解菌的筛选按照彭琛等（2023）方法进行。

1.2   Pu17形态的电镜观察和分子生物学鉴定

挑取纯化后的单菌落接种于LB液体培养基中，30℃ 150 rpm，振荡培养到指数生长期。12 000 g离心30 min，收集菌体。菌体用磷酸缓冲液反复洗涤，将收集到的菌体加入2.5%戊二醛溶液，4℃下保存固定，固定后用PBS洗涤3次，继续用乙醇和醋酸异戊酯脱水、置换，最后经冷冻真空干燥后，喷金制样（苏丹等，2021），利用扫描电子显微镜对菌体形态观察。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物科技有限公司），抽提Pu17菌的基因组DNA，16S rDNA通用引物27F（5'-AGTTTGATCMTGGCT CAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3'）PCR扩增细菌的16 S rDNA序列，采用琼脂糖电泳对PCR产物进行检测，切胶回收送至擎科生物技术公司进行测序。利用SeqMan软件对测序结果进行拼接，并在NCBI上进行Blast比对，选取亲缘关系较近的菌株序列，用软件MEGA 11.0，以Neighbour-Joining法构建系统发育树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。

1.3   Pu17菌株的酶活测定

将Pu17单菌落接种到LB液体培养基中，在150 rpm、30℃的恒温振荡培养箱中培养至指数生长期作为种子液，取0.7 μL菌液点接在七叶苷培养基、纤维素刚果红培养基、蛋白质培养基以及淀粉培养基中，培养72 h后检测其产β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶活性。

1.4   Pu17菌株的降解特性分析

配置烟碱浓度为0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 g/L的烟碱溶液，用分光光度计测定在259 nm波长下的吸光度值，并绘制标准曲线。

将0.1%种子液接种不同烟碱浓度（0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 g/L）的液体培养基，150 rpm、30℃下恒温培养12 h、24 h和48 h。用酶标仪（ELISA）测定其在600 nm处的数值（即OD₆₀₀），每个处理3组重复，测定Pu17对不同浓度烟碱的耐受性。

分别在烟碱浓度为2 g/L液体烟碱培养基中接种0.1%Pu17种子液，分别放置在不同温度（20℃、25℃、30℃、33℃、37℃）摇床中，150 rpm，培养48 h后，ELISA分别测定OD₆₀₀值。

配置pH梯度（5、6、7、8、9）的LB液体培养基。将0.1%Pu17种子液接种到LB液体培养基，30℃培养10 h后，利用ELISA测定OD₆₀₀值。

配置pH梯度（5、6、7、8、9）的液体烟碱培养基（烟碱浓度2 g/L），分别接种0.1%Pu17菌种子液，30℃振荡培养箱150 rpm培养48 h后，利用ELISA测定OD₆₀₀值，使用0.22 μm滤膜进行过滤，将溶液用0.05 mol/L盐酸稀释10倍后采用分光光度计测定波长259 nm的吸光度值，设置3个生物学重复。

1.5   菌株Pu17生长曲线动力学研究

取单菌落Pu17接种到LB液体培养基中，在150 rpm、30℃的恒温振荡器中过夜培养作为种子液。将Pu17种子液分别以0.1%、1.0%和2.0%转接到液体烟碱培养基（2.0 g/L），将Pu17种子液分别以1.0%和2.0%的接种到LB液体培养基中。将接种好的烟碱培养基和LB液体培养基放入至150 rpm、30℃的恒温振荡器中培养，每隔6 h取样，用酶标仪测定OD₆₀₀值。利用Slogistic模型对Pu17进行生长曲线动力学拟合（Gibson et al.，1987）。

式中：x为时间；N_x和N₀为在x时和初始时间的微生物数量；a为最大菌数N_max与初始菌数N₀的差值；T_c为达到最大生长速率的时间；K为在时间点T_c的最大生长速率；λ为生物生长的延滞期。

1.6   Pu17对烟碱的降解能力测定

利用HPLC测定LB培养基和烟碱培养基中的烟碱含量。HPLC标准曲线制作，制作参考专利（彭琛等，2023）。Pu17对烟碱浓度为2.0 g/L烟碱培养基中及LB培养基烟碱降解测定，方法参考Alhazmi（2023）稍作改进。

1.7   Pu17对烟草植株上烟碱的降解速度

按照正常规范化管理烟田进行试验，打顶期（移栽后69 d）。随机选用667 m²打顶期的烟草（云烟87）。在150 rpm、30℃的恒温培养箱中培养Pu17菌液于指数生长期用于喷施，将1 L Pu17菌液稀释到15 L水中，混匀后，对云烟87上中部叶片进行喷施；对照组烟草喷施清水。菌液喷施后，分别在0、24、36、48和60 h随机收集烟草植株从上往下数第五片叶，同时也收集对照烟草植株第五片叶。将收集到的烟草称取鲜重，后放入烘箱将其完全烘干，后称取干重，将称重后的烟叶研磨并用60目筛过滤。将0.1 g烟粉末与0.2 g活性炭混匀放入至150 mL锥形瓶中并向其中加入25 mL 0.5 mol/L盐酸，加热至沸腾后在持续加入5 min，倒入250 mL容量瓶中定容，过滤，取30 mL流出液，紫外分光光度计测定在236 nm、259 nm和282 nm处的吸光值。烟叶中的烟碱收集详细方法参考专利中的方法（彭琛等，2023），烟碱的含量测定参考苏玉龙（2016）方法稍作改进。

2.   结果与分析

2.1   Pu17形态学的鉴定

Pu17在烟碱浓度为2.0 g/L烟碱培养基上生长，Pu17在LB平板上颜色为白色，菌落呈圆形，菌体湿润黏着度高（图 1-A）。革兰氏染色后细菌呈现紫色，表明为Pu17属于革兰氏阳性菌（图 1-B）（Fernandes et al.，2021）。通过扫描电子显微镜对Pu17进行观察，结果表明该菌是一种杆状细菌（图 1-C）。

图  1  Pu17形态特征

注：A，在烟碱固体培养基上培养Pu17的形态特征；B，光学显微镜；C，扫描电子显微镜。

Fig.  1  Morphological characteristics of the bacterium Pu17

Note: A, Morphological characteristics of Pu17 cultured on nicotinic solid medium; B, Observed under optical microscope; C, Observed under scanning electron microscope.

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2.2   基于16S rRNA基因的Pu17系统发育

利用PCR扩增获得16S rDNA，DNA凝胶电泳结果显示Pu17的16S rDNA序列大约为1 400 bp，测序结果确定序列全长1 365 bp。系统进化树分析（图 2）表明Pu17与产脲节杆菌Paenarthrobacter ureafaciens（MH234566.1）序列一致性最高，相似度达99.56%，因此将其命名为菌株Pu17。

图  2  基于16S rRNA Pu17序列与其他相近菌种的系统发育树

Fig.  2  Phylogenetic tree based on 16S rRNA of Pu17 sequence with other related strains

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2.3   Pu17菌株的酶活特性

通过对菌株Pu17进行β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶活性检测，结果可见：Pu17在七叶苷上不变黑，在刚果红平板以及淀粉平板上不出现透明圈，在蛋白平板上出现透明圈，说明菌株Pu17产蛋白酶，不产β-葡萄糖苷酶、纤维素酶以及淀粉酶（图 3）。

图  3  Pu17菌株对4种酶的降解特性

注：A，淀粉酶酶活测定；B，β-葡萄糖苷酶酶活测定；C，纤维素酶酶活测定；D，蛋白酶酶活测定。

Fig.  3  Degradation characteristics of four enzymes by Pu17 strain

Note: A, Determination of amylase activity; B, β-glucosidase enzyme activity determination; C, Determination of cellulase activity; D, Determination of protease enzyme activity.

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2.4   Pu17降解烟碱的特性

Pu17对于烟碱有较强的耐受性，在烟碱浓度为0.1 g/L至8.0 g/L之间都可以正常生长（图 4-A）。Pu17培养12 h、24 h和48 h内，Pu17适宜生长烟碱浓度为2.0 g/L；Pu17菌株在不同温度下在烟碱浓度为2 g/L烟碱培养基中生长情况（图 4-B），其中30℃下，培养48 h，Pu17生长最佳。菌株Pu17在烟碱浓度为2.0 g/L烟碱培养基中，48 h不同pH值下烟碱降解和菌体的生长速度检测结果（图 4-D）。Pu17菌在pH为5~8条件下都可以生长，在中性偏弱酸生长最快，Pu17最适合pH值为6，最高烟碱降解率为92.50%（图 4-D）。说明Pu17菌对烟碱浓度为2.0 g/L烟碱培养基中可以有效降解烟碱。

图  4  Pu17菌株降解烟碱的特性

注：A，Pu17对于不同浓度烟碱的耐受性；B，Pu17菌在不同温度下的生长速率；C，Pu17对不同pH的耐受性；D，Pu17对2 g/L的烟碱降解速率。图中数值为平均值±标准误（n=3)，柱上不同字母和星号表示不同处理达到差异显著（P＜0.05，方差分析中的LSD和Duncan检验）。

Fig.  4  Degradation characteristics of Pu17 strain

Note: A, Tolerance of Pu17 to different concentrations of nicotine; B, Growth rate of Pu17 at different temperatures; C, Tolerance of Pu17 to different pH in pure LB; D, Degradation of 2 g/L nicotine by Pu17. Values in the figure were the mean±SE (n=3), and different letters or asterisk above each bar indicated a significant difference (P < 0.05, LSD and Duncan in ANOVA).

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2.5   菌株生长曲线动力学研究

将Pu17菌株分别以0.1%、1.0%、2.0%接种量接种至烟碱浓度为2.0 g/L纯烟碱培养基中，采用matlab软件对Pu17菌株的生长曲线进行拟合，结果如表 1所示。菌株Pu17在烟碱培养基中的生长速率曲线如图 5所示。Pu17菌株以极低的接种量（0.1%）接种在烟碱浓度为2.0 g/L的纯烟碱培养基中可以正常生长繁殖，且Pu17菌株的生长规律符合逻辑斯蒂生长曲线，将Pu17菌株以接种量0.1%、1.0%、2.0%接种至烟碱浓度为2.0 g/L纯烟碱培养基中，Pu17菌株生长延滞期λ分别为27.91 h、12.16 h和11.68 h。随着接种量的增加，Pu17在2.0 g/L烟碱培养基中的生长延滞期逐渐缩短。

图  5  Pu17不同接种量在烟碱浓度为2.0 g/L培养基中的生长拟合曲线

注：A，Pu17菌不同接种量在烟碱浓度为2.0 g/L纯烟碱培养基中的生长拟合曲线；B，Pu17接种量为2%时在烟碱浓度为2.0 g/L纯烟碱培养基中不同时间的生长拟合曲线；C，Pu17不同接种量在烟碱浓度为2.0 g/L LB培养基中的生长拟合曲线；D，Pu17接种量为2%时在烟碱浓度为2.0 g/L LB培养基中不同时间的生长拟合曲线。

Fig.  5  Growth fitting curves of Pu17 inoculated at different doses in medium with nicotine concentration of 2.0 g/L

Note: A, Growth fitting curves of Pu17 bacteria with different inoculations in nicotine medium with nicotine concentration of 2.0 g/L; B, Growth curves of Pu17 inoculated at 2.0% in pure nicotinic medium with nicotine concentration of 2.0 g/L for different time periods; C, Growth fitting curves of Pu17 with different inoculations in LB medium with nicotine concentration of 2.0 g/L; D, Growth curves of Pu17 inoculated at 2.0% in LB medium with nicotine concentration of 2.0 g/L for different time periods.

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将Pu17菌株分别以1.0%和2.0%接种量接种至烟碱浓度为2.0 g/LLB培养基中，采用matlab软件对Pu17菌株的生长曲线进行拟合，结果如表 2所示。Pu17菌株以1.0%和2.0%接种量接种至烟碱浓度为2.0 g/LLB培养基中，Pu17菌株的生长规律符合逻辑斯蒂生长曲线，延滞期λ分别为2.11 h和0.36 h。如图 5-C和5-D所示，Pu17菌株在2.0 g/L的LB培养基中的生长延滞期极短，且随着接种量增大呈缩短趋势。通过延滞期对比，Pu17菌株在烟碱浓度为2.0 g/LLB培养基中的生长速率快于在纯烟碱培养基中的生长速率（表 1和表 2）。

2.6   Pu17对不同培养基中烟碱的降解能力

Pu17在烟碱培养基中对烟碱的降解情况（图 6-A）。Pu17菌在烟碱浓度为2.0 g/L烟碱培养基中可以正常生长繁殖，并可以有效降解烟碱（图 6-A）。HPLC色谱峰图显示Pu17菌株在36 h即可降解大部分烟碱，48 h对烟碱降解率达到92.75%以上。通过HPLC色谱峰图分析可知，Pu17将烟碱转化为烟碱类似物逐步降解烟碱。

图  6  2.0%接种量对2.0 g/L烟碱浓度的不同培养基中烟碱的降解情况

注：A，2%接种量的Pu17对2.0 g/L烟碱浓度的纯烟碱培养基中的烟碱降解速率；B，2%接种量对2.0 g/L烟碱浓度的LB培养基中烟碱的降解速度。

Fig.  6  Degradation rate of nicotine in different medium with 2.0 g/L nicotine concentration at 2.0% inoculation rate

Note: A, The rate of nicotine degradation in a pure nicotine medium with a nicotine concentration of 2.0 g/L determined by 2.0% inoculation of Pu17; B, Degradation rate of nicotine in LB medium with 2.0 g/L nicotine concentration at 2.0% inoculation rate.

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Pu17菌株在烟碱浓度为2.0 g/L LB培养基中的降解情况（图 6-B）。Pu17菌在烟碱浓度为2.0 g/L LB培养基中快速生长，但在48 h时仍存在大部分烟碱。在54 h，烟碱才被大量降解；60 h降解率达90.57%。Pu17菌在烟碱浓度为2.0 g/L LB培养基中的生长速率快于在纯烟碱培养基的生长速率，但Pu17菌在中烟碱浓度为2.0 g/L LB中降解烟碱效率远远低于烟碱培养基（图 6）。因此推测该菌在有其他营养物质存在的情况下会优先利用其他营养物质，同时缓慢降解烟碱；或在该菌降解烟碱的代谢通路中，Pu17先将烟碱降解为某种烟碱类似物后，若有其他营养物质存在的条件下，优先利用其他营养物质进行生长代谢。Pu17菌株烟碱降解率与生长量呈正相关的关系。在2种培养基中，随着Pu17菌株的生长，烟碱不断被降解。在烟碱培养基中，培养48 h，Pu17菌株生长量达到最大，此时烟碱的降解率达92.75%，在烟碱浓度为2 g/L LB培养基中，培养60 h，Pu17菌株生长量达到最大，此时烟碱的降解率达90.57%（图 5~图 6）。

2.7   Pu17对烟草植株上烟碱的降解

Pu17喷施烟草后，在0~60 h之间，利用紫外分光光度计测定烟草植株中的烟碱含量。喷施Pu17，24~60 h都可以显著降低烟叶上的烟碱含量（图 7）。通过t检验分析，喷施Pu17后24 h时，烟碱含量与对照植株相比达到极差异显著水平（P < 0.0001），而48 h和60 h时相比于CK组烟叶叶片中的烟碱含量也达到差异显著水平（P < 0.05）。本研究说明喷施Pu17后，随着时间的推移，烟叶叶片中的烟碱含量逐渐升高，呈现回原趋势，但是仍然达到差异水平，说明Pu17能够降解烟草植株里的烟碱。

图  7  喷施Pu17对烟叶中烟碱含量的降解效果

注：图中数值为平均值±标准误（n=3），柱上不同星号表示烟碱含量差异显著（****，P＜0.0001；***，P＜0.001；*，P＜0.05；ns，P＞0.05；多重t检验）。

Fig.  7  Degradation effect of Pu17 on nicotine content in tobacco leaves

Note: Each bar presented the mean±SE (n=3), and asterisk above each bar indicated a significant difference of the content of nicotine in tobacco leaves (****, P < 0.0001;***, P < 0.001;*, P < 0.05;ns, P > 0.05;multiple t tests).

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3.   结果与讨论

利用微生物降解烟碱是最有发展前景的方法。节杆菌Arthrobacter sp.是降解烟碱最重要的一类微生物。节杆菌属的降解途径从吡啶环开始降解尼古丁，又称吡啶途径。节杆菌属利用烟碱唯一的碳源、氮源和能源生长（Wang et al.，2012；Valentine et al.，2018）。本研究从湖南永州市烟叶生产技术中心烟草种植区内土壤中分离得到一株烟碱降解菌，通过形态学、16S rRNA序列同源性分析，系统发育和酶活鉴定，初步确定为节杆菌属产脲节杆菌，命名为Pu17菌株。具体是否为该属新种还需进一步做代谢组分析分析、基因组平均核苷酸相似度和全基因组测序。

目前国内外从节杆菌属Arthrobacter sp.中分离烟碱降解菌报道很多。但是节杆菌属烟碱降解菌效率和特性差异很大，应用前景不同。郭青青等从土壤中分离出高效烟碱降解节杆菌P3，36 h内降解率可达99.06%；马林从土壤中分离的嗜烟碱节杆菌Z3，培养78 h后烟碱降解80%（马林，2005；Wang et al.，2009；江吉红等，2011；孔雯等，2011；Wang et al.，2012；Wei et al.，2014；Valentine et al.，2018；苏丹等，2021；郭青青等，2022）。本研究从土壤中筛选获得Pu17属于节杆菌，HPLC检测显示出Pu17具有高效烟碱降解性能。Pu17菌株在烟碱浓度为2 g/L烟碱培养基可以有效降解烟碱，在36 h即可降解大部分烟碱，48 h烟碱降解率达到92.75%以上（图 6-A）。通过HPLC色谱峰图分析Pu17菌株会将烟碱转化为烟碱类似物逐步降解烟碱（图 6-A）。本研究与其他人报道一致（马林，2005；李颖等，2006；申星等，2013；张文龙等，2013；帖金鑫等，2014）。

烟碱降解菌有不同的降解特性，培养的pH值、温度和营养状态下表现不同降解效果。本研究中，发现菌株Pu17降解烟碱的效率与培养的温度、pH和底物浓度密相关。温度对菌株Pu17降解烟碱的影响主要是因为温度对微生物的增殖有着显著影响，菌株Pu17的适宜降解温度是30℃（图 4-B）。本研究结果与Wang等人报道的结果相似，当温度超过37℃或低于20℃时，烟碱的降解能力急剧下降（Wang et al.，2012；Valentine et al.，2018）。烟碱不仅为烟碱降解菌提供碳源和氮源，为微生物的生长提供营养物质，也具有高毒性，过高的烟碱浓度会抑制微生物的生长（董春霞等，2011；方超等，2017）。节杆菌属菌株D4，培养18 h时D4对1.0 g/L烟碱降解率可达到90%以上；当烟碱浓度大于或等于4.0 g/L时，D4菌生长受到明显抑制（邓帅军等，2022）。本研究发现Pu17菌株具有较高烟碱耐受力和烟碱降解率，发现该菌株在烟碱浓度0.1~7.0 g/L内生长良好且有较高的烟碱降解能力（图 4）。烟碱浓度大于或等于8.0 g/L时菌株生长受到明显抑制（图 4-A）。这结果与邓帅军等（2022）报道的烟碱降解微生物特点的相一致。Pu17相比苍白杆菌P3a（5.0 g/L）、苍白杆菌SJY1（3.0 g/L）和假单胞菌HF-1（2.0 g/L）的烟碱耐受性，Pu17有很强的耐受性（Yu et al.，2015；郭青青等，2022；王萌蕾等，2023）。Pu17在pH6.0~7.0之间有显著的降解速率，说明中性或弱酸性环境有助于菌株Pu17对烟碱的降解（图 4-C）。这结果与节杆菌属菌株P3a、假单胞菌属HF-1和节杆菌aRF-1相似，最佳pH为6.5~7.0（郭青青等，2022）；也与Wang等（2012）报道Pseudomonas sp.CS3对烟碱的最适pH也为中性环境。通过HPLC检测Pu17对烟碱质量浓度为2 g/L不同pH值烟碱培养基中的烟碱降解效率不一致，适宜pH值为6，此时Pu17对烟碱降解率为92.75%（图 4-D）。

生长-降解关系显示Pu17生长速度与烟碱降解速度具有同步性（图 6）。Pu17生长速度与烟碱降解速度的同步性，进一步说明Pu17可以通过降解烟碱来获取自身生长繁殖所需要的能量，这与Wang和Li等人报道的烟碱降解微生物的生长-降解关系相一致（Wang et al.，2009；Li et al.，2010）。有关烟碱与其他营养物质同时存在时，烟碱降解菌如何对烟碱的选择降解未见报道。本研究利用HPLC动态了比较了Pu17对LB培养基中的烟碱和烟碱培养中的烟碱降解情况（图 6-A、B），显示Pu17在烟碱浓度为2 g/L纯烟碱培养基中具有较高的烟碱降解率，在其他营养物质的存在下，Pu17对于烟碱的降解速率明显降低，因此推测Pu17在有其他营养物质存在的情况下会优先利用其他营养物质，同时缓慢降解烟碱；或在该菌降解烟碱的代谢通路中，Pu17菌株先将烟碱降解为某种烟碱类似物后，若有其他营养物质存在的条件下，优先利用其他营养物质进行生长代谢。本研究与已报道的研究结果相比有一致性，也有一定的独特性（龙章德等，2013；梅枫等，2017；苏丹等，2021；王萌蕾等，2023）。

到目前为止，直接将降解菌应用到鲜株的烟草中未见报道。国内只有郭青青从土壤中分离出一株高效降解烟碱的节杆菌Arthrobacter sp. P3a，将菌株P3a培养24 h的发酵液，100 mL（5 × 10⁹ CFU/mL）菌液喷洒1 kg新鲜烟叶。紫外分光光度法烟碱含量，结果发现P3a降低1 kg新鲜烟叶中55.11%的烟碱（郭青青等，2022）。本研究将Pu17菌株发酵液直接喷施在烟田中的烟草。结果发现Pu17喷施田中的烟草24 h后，降解率最高，烟碱降解率为38.72%（图 7）；喷施烟草60 h，烟碱降解率减低，烟叶降解率为14%（图 7）。说明随着时间的推移，烟叶叶片中的烟碱含量逐渐升高，呈现回原趋势，但是仍然达到差异水平（图 7）。今后，仍需进一步展开Pu17对烟草植株的降解机理研究，摸清其降解机制，为环境保护提供新思路。