桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa Fisher & La Salle是一种重要的入侵性致瘿害虫，隶属于膜翅目Hymenoptera姬小蜂科Eulophidae，通过在桉树幼嫩部位产卵形成虫瘿，影响桉树的生长与发育，给桉树产业造成巨大的经济损失（Huanget al.，2018）。桉树枝瘿姬小蜂原本活动于澳大利亚，于2000年扩散至以色列，2004年被Mendel记录为一个新种（Mendelet al.，2004），后传播到世界各地，包括欧洲地中海地区、非洲、亚洲和南美洲等地（Dittrich et al.，2012）。2007年，在我国广西壮族自治区东兴市首次发现该害虫（吴耀军等，2009）。桉树枝瘿姬小蜂可危害赤桉Eucalyptus camaldulensis、邓恩桉Eucalyptus dunnii、窿缘桉Eucalyptus exserta、巨桉Eucalyptus grandis、柳叶桉Eucalyptus saligna、细叶桉Eucalyptus tereticornis等多个品种，其中巨园桉Eucalyptus grandis×Eucalyptus tereticornis DH 201-2无性系为受害严重的高度易感品种（Nyeko et al.，2007；Quang et al.，2009；武海卫等，2009）。

气味结合蛋白（Odorant-binding proteins，OBPs）属于一类小分子水溶性蛋白，存在于昆虫嗅觉感受器淋巴液中，参与了对环境中气味分子的识别、结合和运输，在昆虫整个嗅觉系统识别气味分子过程中发挥着重要作用（Pelosi et al.，2014）。根据其氨基酸序列中保守半胱氨酸的数目以及位置，气味结合蛋白可分为Classic OBPs、dimer OBPs、Plus-C OBPs、Minus-C OBPs及Atypical OBPs 5个亚类（Song et al.，2018）。Classic OBPs是指大多数具有6个保守的半胱氨酸残基，可以形成3个二硫键的气味结合蛋白，而膜翅目的Classic OBPs结构通式一般为：C1-X23-35-C2-X3-C3-X27-45-C4-X7-14-C5-X8-C6（C为半胱氨酸缩写，X表示其它非保守半胱氨酸的氨基酸残基）（Xu et al.，2009）。昆虫主要依靠其高度敏感的嗅觉系统探测和定位寄主植物，而气味结合蛋白与气味分子的特异性结合，使得昆虫被挥发物影响从而产生相应的行为和反应（Sun et al.，2018；Baldwin et al.，2021）。

自2007年国内首次发现了桉树枝瘿姬小蜂以来，陆续有学者展开了相关研究，国内外研究报道主要集中于桉树枝瘿姬小蜂的生物学特性（黄梦伊等，2020）、体内微生物（蔻冀蒙等，2020）及天敌（Huang et al.，2018）等方面。但是针对桉树枝瘿姬小蜂嗅觉蛋白的研究尚未见报道。本文利用克隆技术成功获得桉树枝瘿姬小蜂头部高表达的7个LinvOBPs基因的全长序列，探究LinvOBPs的序列信息及其关键挥发物处理下的表达特性，为明确桉树枝瘿姬小蜂特异性识别寄主植物的分子机制和防治该害虫提供新的思路。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试昆虫桉树枝瘿姬小蜂雌虫采集于广西大学教学实习基地苗圃内种植的1~2年生巨园桉DH 201-2，采集当天刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌虫，完全浸泡于RNA样本保存液中，4℃过夜，保存于-20℃冰箱中。供试挥发物利用动态顶空吸附法采集寄主植物巨园桉DH 201-2的组成型挥发物。

1.2   材料处理

采集当天刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌虫，饥饿处理6 h后放入50 mL玻璃瓶（试验前用无水乙醇清洗后烘干）内，在瓶口包上单面带孔的气体采集袋（带孔面朝向玻璃瓶内，保证试验正常进行的同时不污染味源），用标准化合物配制成浓度为1 μg/μL的单一挥发物（桉叶油醇、甲基戊酮醇、萜品烯、对伞花烃、α-蒎烯、右旋萜二烯）和混合挥发物（桉叶油醇∶萜品烯∶甲基戊酮醇∶对伞花烃=19∶5∶2∶2），用移液枪吸取10 μL上述挥发物到烘干后的定性滤纸（2 cm × 1 cm）上设置为试验组，挥发2 s后放入带孔的气体采集袋中，使挥发物通过孔隙充满整个玻璃瓶，对照组则直接放入烘干后的定性滤纸。每组共处理160头雌虫，设置3个重复，持续处理6 h，每头雌虫只测试1次。

1.3   桉树枝瘿姬小蜂头部总RNA的提取及cDNA的合成

选取TRIzol法并结合试剂盒RNeasy^® Plus Mini Kit，在超净工作台中提取雌虫头部总RNA。参考试剂盒TransScript^® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书反转录为cDNA。

1.4   PCR引物设计和基因克隆

参考前期课题组的桉树枝瘿姬小蜂雌虫头部转录组测序注释结果（周静，2023），根据注释为OBPs基因的TPM均值大小，筛选TPM均值最高且序列完整的7个基因（OBP2、OBP5、OBP7、OBP9、OBP11、OBP18、OBP23），利用Primer Premier 6设计引物（表 1）。PCR反应体系（25 μL）：T3 Super PCR Mix 22 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，模板cDNA 1 μL。反应条件：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，51~56℃退火15 s，72℃延伸20 s，35个循环，4℃保存。测序比对成功的PCR产物利用OMEGA的Gel & PCR Clean UP Kit D2000试剂盒进行切胶回收与纯化，经由pEASY^®-T1 Cloning Kit试剂盒克隆于Peasy-T1载体，导入大肠杆菌（Escherichia coli）Trans1-T1感受态细胞，在含有氨苄的LB固体培养基上进行涂板，37℃过夜培养，菌液进行阳性克隆检测，用试剂盒Plasmid Extraction Mini Kit提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将条带单一明亮的质粒送至北京擎科生物科技（南宁）有限公司进行测序。根据测序结果与OBPs基因序列进行Blast比对，从而获得正确的序列。

1.5   实时荧光定量PCR

以处理的雌虫为材料，进行RNA提取和反转录，qRT-PCR的引物信息见表 2。反应体系（20 μL）：Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，上游引物（10 μM）0.4 μL，下游引物（10 μM）0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O 8.2 μL。反应条件：预变性94℃ 30 s，循环反应45个：94℃ 5 s，60℃ 30 s。以β-actin为内参，每个样品重复点样4次，测定溶解曲线的反应条件：65~94℃，每增加0.5℃保持5 s。

1.6   数据处理

用NCBI在线工具Open Reading Frame Finder查询OBPs基因的ORF区域，使用

SignalP 6.0对信号肽序列进行预测，expasy（https://web.expasy.org/compute_pi）预测目的基因的相对分子质量和理论等电点，ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析OBPs克隆序列所包含的氨基酸种类及组成情况；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=nps%20_sopma.html）预测蛋白的二级结构；使用NCBI在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白的保守结构域；SnapGene 6.0.2将7条OBPs与白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea的5条OBPs进行同源性比对；利用MEGA 11.0软件的最大似然法（Maximum likelihood），设置Bootstrap为1 000，将7条桉树枝瘿姬小蜂OBPs的氨基酸序列与其它3种膜翅目昆虫的OBPs的氨基酸序列，其中包括33条白蛾周氏啮小蜂OBPs，14条丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的OBPs和39条丽蚜小蜂

Encarsia formosa的OBPs构建系统进化树；qRT-PCR检测数据，根据溶解曲线检验数据的可靠性，记录各β-actin基因的Ct值，用2^-ΔΔCt计算基因的表达量；使用IBM SPSS Statistics 26.0对实验数据进行统计与分析，使用Origin 2018进行绘图。

2.   结果与分析

2.1   桉树枝瘿姬小蜂LinvOBPs的克隆

根据表达量高低、ORF的完整性以及是否具有信号肽筛选出7条OBPs基因，分别命名为LinvOBP2（GenBank登录号为OQ443056）、LinvOBP5（GenBank登录号为OQ443057）、LinvOBP7（GenBank登录号为OQ443058）、LinvOBP9（GenBank登录号为OQ443059）、LinvOBP11（GenBank登录号为OQ443060）、LinvOBP18（GenBank登录号为OQ443061）和LinvOBP23（GenBank登录号为OQ443062）。这7条LinvOBPs基因开放阅读框长度均400 bp左右，单菌落PCR扩增后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测得到相应的目的条带（图 1）。根据公司测序结果分析可知，LinvOBP2基因全长458 bp，LinvOBP5基因全长511 bp，LinvOBP7基因全长473 bp，LinvOBP9基因全长382 bp，LinvOBP11基因全长522 bp，LinvOBP18基因全长487 bp，LinvOBP23基因全长465 bp。

图  1  LinvOBPs基因克隆结果

注：M，DNA Marker DL2000；1，LinvOBP2；2，LinvOBP5；3，LinvOBP7；4，LinvOBP9；5，LinvOBP11；6，LinvOBP18；7，LinvOBP23。

Fig.  1  Gene cloning results of LinvOBPs

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2.2   桉树枝瘿姬小蜂LinvOBPs的序列分析

克隆得到的7条LinvOBPs基因都具有完整的开放阅读框，开放阅读框的长度在400 bp左右，LinvOBP2、LinvOBP5、LinvOBP7、LinvOBP9、LinvOBP11、LinvOBP18、LinvOBP23开放阅读框的长度分别为408、435、396、378、396、411和414 bp，编码125~137个氨基酸，均含有大量的丙氨酸（ALA）、赖氨酸（LYS）、缬氨酸（VAL）。7条LinvOBPs均具有气味结合蛋白的典型结构，包含6个保守半胱氨酸位点，预测分子量大小在14~16 kDa，N端均有一段由约15~25个氨基酸残基组成的信号肽序列，负责引导气味结合蛋白。等电点在5~9，蛋白脂肪指数在70~106，LinvOBP18、LinvOBP23不稳定指数大于40，蛋白不稳定，LinvOBP2、LinvOBP5、LinvOBP7、LinvOBP9、LinvOBP11不稳定指数均小于40，蛋白较稳定。LinvOBP2、LinvOBP5、LinvOBP32基因编码蛋白的平均亲水性小于零，为疏水性蛋白，而LinvOBP27、LinvOBP9、LinvOBP11、LinvOBP11基因编码蛋白的平均亲水性大于零，为亲水性蛋白。二级结构预测结果表明（表 3），7条LinvOBPs的二级结构类型相似，均含有大量的α-螺旋、无规卷曲和少量的延伸链及β-转角，对蛋白的结构起支撑作用。

2.3   系统发育分析

将桉树枝瘿姬小蜂的7条LinvOBPs氨基酸序列与周氏啮小蜂的5条CcOBPs进行同源性比较，发现其均具有气味结合蛋白的典型特征，7条LinvOBPs都含有6个保守的半胱氨酸（图 2），结构通式为“C1-X23-29-C2-X3-C3-X26-40-C4-X8-11-C5-X4-8-C6”。将桉树枝瘿姬小蜂的7条LinvOBPs氨基酸序列和86条同源性较高的膜翅目昆虫OBPs氨基酸序列（33条白蛾周氏啮小蜂CcOBPs、14条丽蝇蛹集金小蜂NvitOBPs和39条丽蚜小蜂EfOBPs）一起构建系统进化树。结果显示，桉树枝瘿姬小蜂LinvOBPs与白蛾周氏啮小蜂CcOBPs的亲缘关系最近，LinvOBP2和CcOBP9聚为紧密的一支，LinvOBP5和CcOBP32、LinvOBP7和CcOBP14分别聚为紧密的一支，LinvOBP9和CcOBP1具有很高的近源性，LinvOBP11与CcOBP29亲缘关系较近，LinvOBP18和CcOBP24亲缘关系近，LinvOBP23和CcOBP33亲缘关系近，推测桉树枝瘿姬小蜂的LinvOBPs与白蛾周氏啮小蜂CcOBPs可能具有相似的功能（图 3）。

图  2  桉树枝瘿姬小蜂LinvOBPs与周氏啮小蜂CcOBPs的同源性比较

注：C1~C6，6个保守的半胱氨酸。

Fig.  2  Similarity alignment among LinvOBPs of Leptocybe invasa and CcOBPs of Chouioia cunea

Note: C1-C6, Six conserved cysteines.

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图  3  桉树枝瘿姬小蜂与其它3种膜翅目昆虫OBPs的系统发育树

注：Cc，白蛾周氏啮小蜂；Nvit，丽蝇蛹集金小蜂；Ef，丽蚜小蜂。

Fig.  3  Phylogenetic tree of the OBPs of Leptocybe invasa and three other hymenopteran insects

Note: Cc, Chouioia cunea; Nvit, Nasonia vitripennis; Ef, Encarsia formosa.

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2.4   不同挥发物处理后LinvOBPs表达量的变化

经不同挥发物诱导处理后，各个基因的表达量在不同处理间存在显著差异。分析空白对照组数据可知，LinvOBP2经右旋萜二烯、对伞花烃、桉叶油醇、α-蒎烯、甲基戊酮醇处理与空白处理存在显著差异，经诱导处理后相对表达量上调，萜品烯、混合诱导处理与空白处理没有显著差异；LinvOBP5经对伞花烃诱导处理与空白处理存在显著差异，经诱导处理后相对表达量上调，桉叶油醇诱导处理与空白处理没有显著差异，其余经α-蒎烯、甲基戊酮醇、右旋萜二烯、萜品烯和混合与空白处理存在显著差异，且诱导处理后相对表达量下调；LinvOBP7经甲基戊酮醇、对伞花烃、右旋萜二烯、桉叶油醇、α-蒎烯诱导处理与空白处理存在显著差异，诱导处理后相对表达量上调，萜品烯和混合与空白处理没有显著差异；LinvOBP9经对伞花烃、右旋萜二烯、桉叶油醇诱导处理与空白处理存在显著差异，诱导处理后相对表达量上调，甲基戊酮醇、α-蒎烯、萜品烯、混合与空白处理没有显著差异；LinvOBP11经对伞花烃诱导处理与空白处理存在显著差异，诱导处理后相对表达量上调，其余处理与空白处理没有显著差异；LinvOBP18经甲基戊酮醇、对伞花烃、桉叶油醇、萜品烯和右旋萜二烯诱导处理与空白处理存在显著差异，诱导处理后相对表达量上调，α-蒎烯、混合与空白处理没有显著差异；LinvOBP23经对伞花烃、桉叶油醇诱导处理与空白处理存在显著差异，诱导处理后相对表达量上调，其余处理与空白处理没有显著差异。整体上看，经对伞花烃诱导处理的7个LinvOBPs相对表达量上调；经桉叶油醇诱导处理后除LinvOBP2相对表达量出现下调，其余LinvOBPs相对表达量上调；经右旋萜二烯处理后除LinvOBP2、LinvOBP23相对表达量出现下调，其余LinvOBPs相对表达量上调。与空白对照相比，LinvOBP7经7个诱导处理后相对表达量均是上调（图 4）。

图  4  不同处理后LinvOBPs的相对表达量

注：数据为平均值±标准误（n=3）。柱上不同小写字母代表不同处理下同一基因的相对表达量存在显著差异（P < 0.05）。

Fig.  4  Relative expression of LinvOBPs after different treatments

Note: Values were mean ± SE of three replications. Different lowercase letters on the column represented significant differences in the relative expression of the same gene under different treatments (P < 0.05).

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3.   结论与讨论

不同昆虫气味结合蛋白的结构具有相似性，一般长度约400 bp，含有6个保守的半胱氨酸，序列N端具有信号肽切割位点，相对分子质量较小，等电点较低（Wang et al.，2020；李良斌等，2023）。本研究克隆得到7个LinvOBPs全长序列，属于典型的OBPs，与已经报道的昆虫OBPs基因具有相同的特点（Hull et al.，2014；Missbach et al.，2015）。

在触角内高度表达的OBPs基因能够在性信息素和挥发物小分子的识别过程中发挥重要作用。如桃小食心虫Carposina sasakii触角内高度表达的5个CsasOBPs基因在交配期时的表达量远远超过其他部位（李凯旋等，2022）。在梨小食心虫Grapholitha molesta雌成虫触角内高度表达的GmolOBP14基因的功能主要与识别寄主植物、定位产卵场所有关，而与信息素的识别无关（陈秀琳等，2018）。小菜蛾Plutella xylostella雄虫触角中高度表达的气味结合蛋白基因Pxyl OBP31主要参与寻求配偶及定位寄主植物环节（覃江梅等，2016）。甘蔗黄螟Chilo infuscatellus触角转录组中高度表达的3个PBPs（CinfPBP1、CinfPBP2和CinfPBP3）和2个GOBPs（CinfGOBP1和CinfGOBP2），分别与性信息素和甘蔗Saccharum officinarum挥发物表现出很强的亲和力（Liu et al.，2020）。在系统发育分析中，桉树枝瘿姬小蜂的LinvOBPs与白蛾周氏啮小蜂的CcOBPs显示出较近的亲缘关系。这种关系可能反映了两种昆虫在生态位、食性或其它生物学特性上的相似性。此外，通过构建系统进化树，可以推测LinvOBPs与CcOBPs可能具有相似的功能，比如参与识别特定的气味分子，进而在寻找食物、配偶或寄主等行为中发挥关键作用。其中与LinvOBP9聚在一起的CcOBP1被报道在寻找寄主美国白蛾Hyphantria cunea过程中发挥重要作用，CcOBP1能够与美国白蛾蛹的挥发物很好地结合，并产生相应的驱避效应（相芳伟等，2018）。故推测LinvOBP9的功能也与寄主识别有关，但具体作用还需进一步验证。

气味结合蛋白的功能具有多样性，基因表达量的变化与其功能息息相关，如云斑天牛Batocera lineolata取食寄主后，触角内7个OBPs和3个CSPs的表达量均高于未取食时，并且表达量的变化在不同寄主条件下存在差异，说明这10个嗅觉相关基因参与云斑天牛的寄主选择行为（杨洋等，2017）。但是，OBPs不仅能参与识别寄主植物，还能在昆虫生长发育过程中发挥重要作用。桃蛀果蛾Carposina sasakii的OBP4和OBP17基因在交尾前后基因表达量发生明显变化，说明OBP4和OBP17基因的功能与调节桃蛀果蛾的发育状态有关（胡晓雯，2018）。中华蜜蜂Apis cerana cerana触角内的4个AcNPC2蛋白在低温胁迫下表达量明显升高，故推测AcNPC2s的功能与中华蜜蜂的低温适应性有关（张莉，2022）。不同挥发物处理对LinvOBPs表达量的影响是本研究的一个重要方面。试验结果表明，不同LinvOBPs对于不同挥发物的响应存在显著差异。一些挥发物能够显著上调LinvOBPs的表达量，而另一些则可能导致表达量下调或无显著差异。这种差异可能与挥发物的种类、浓度以及处理时间等因素相关。LinvOBP7经7个诱导处理后相对表达量都是上调，推测LinvOBP7的功能与寄主识别有关。值得注意的是，对伞花烃、桉叶油醇、右旋萜二烯处理能够上调多个LinvOBPs的表达量，这提示对伞花烃、桉叶油醇、右旋萜二烯可能是桉树枝瘿姬小蜂的一种重要识别信号。7个LinvOBPs基因均在识别寄主桉树过程中发挥重要作用，LinvOBPs对对伞花烃、桉叶油醇、右旋萜二烯的识别有利于揭示桉树枝瘿姬小蜂特异性识别寄主桉树的分子机制。未来的研究可以进一步探索LinvOBPs与特定挥发物之间的相互作用机制，以及这些机制如何影响桉树枝瘿姬小蜂的生物学特性，从而为昆虫防治和生态调控提供新的思路和策略。