昆虫是世界上分布最广、数量最多的节肢动物，在平衡生态、维护生物多样性等方面都有重要作用，对人类生活有着深远影响（Basset et al.，2012）。昆虫和植物作为陆地生物群落中的重要组成部分，二者间的相互作用是多方面的（钦俊德和王琛柱，2001）。一方面，植物在被昆虫取食后会通过调节自身酶活、次生代谢物及生长发育来抵御昆虫的危害，如卷果涩荠Malcolmia scorpioide在受到油菜筒喙象Lixus ochraceus取食后会通过短期的补偿生长和繁殖器官的超补偿生长等适应策略，提高卷果涩荠存活率和繁殖成功率（文晓虎，2023）；Köllner等（2013）研究发现斜纹夜蛾Spodoptera litura的取食会诱导玉米叶片中倍半萜的空间分布变化，倍半萜仅在受伤部位至叶尖之间产生，并呈现从叶尖到受害部位的梯度增加趋势。另一方面，在昆虫与植物长期的协同进化过程中，昆虫也进化出了克服植物对其的防御反应的机制，如稻飞虱可以通过体内的细胞色素P450单加氧酶、谷胱甘肽S-转移酶、羧酸酯酶、和乙酰胆碱酯酶等多种解毒酶来降低或消除水稻含有的多种具有杀褐飞虱作用的代谢物（王雅宣等，2024）；咖啡果小蠹Hypothenemus hampei在取食咖啡果实的过程中，其肠道内的假单胞菌能够合成脱甲基酶协助分解植物的有毒次生代谢物质咖啡因，从而使该虫能够取食并适应其寄主（Ceja-Navarro et al.，2015）；玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera的共生菌Wolbachia可以降低玉米多种防御相关基因和JA调控基因的表达（Barr et al.，2010）；巨学阳（2022）研究发现将从草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的肠道和唾液中分离出来的细菌分别回接到草地贪夜蛾后对玉米植株进行危害，部分细菌处理的草地贪夜蛾取食会导致玉米的防御酶下降。

越来越多的研究表明昆虫细菌，即肠道、唾液及排泄物等的细菌在宿主与植物的互作中具有重要功能，如改变植物免疫酶活性、影响植物防御反应、抑制钙离子浓度升高等（Shikano et al.，2017；赵晨晨，2020）。唾液细菌，也称为反吐液共生细菌（Chung et al.，2013），这些微生物可以参与操纵植物对昆虫取食的反应，抑制植物防御，协助昆虫取食（Wang et al.，2017）。如马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata幼虫唾液和肠道中的单胞菌属、假单胞菌属和肠杆菌属这3种共生菌对番茄茉莉酸（JA）引起的防御反应均具有抑制作用（都慧和王晓伟，2022），感染兼性共生菌Hamiltonella defensa的烟粉虱Bemisia tabaci取食番茄后番茄中JA和JA相关的抗虫诱导的防御受到抑制，仅用该种群的唾液对番茄进行处理也表现出同样的抑制效果，说明该菌可以通过昆虫的唾液分泌到植物上发挥作用（Su et al.，2015；卢盈希等，2024），同样地，扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis的唾液细菌体外接种棉花可以抑制JA通路基因的表达，并激活SA反应基因的表达，最终抑制植物的诱导防御，从而增强粉蚧的适应性（Zhao et al.，2023）。

番茄潜叶蛾Tuta absoluta起源于南美洲的秘鲁，是一种对番茄产业具有毁灭性危害的世界性入侵害虫（Desneux et al.，2010），危害严重时可造成番茄减产80%~100%（Zhang et al.，2021）。截至2023年底，番茄潜叶蛾已扩散至我国19个省市390多个县，其危害面积已达到200多万亩（屈春侠等，2021；张桂芬等，2024），目前呈进一步扩散蔓延态势，严重影响了我国蔬菜、粮食作物、水果、烟草、糖料作物等的生产（Campos et al.，2017）。番茄潜叶蛾寄主范围广泛，可为害19科40种作物，与其对寄主植物的防御有较好的适应有关，有研究报道共生菌能够帮助昆虫提高对寄主植物的适应性，例如共生菌可协助宿主昆虫降解植物大分子营养物质、次生物质及降低植物防御等。朱晗（2021）研究发现香樟齿喙象Pagiophloeus tsushimanus肠道中存在多株可对樟脑、芳樟醇或桉叶油醇降解的共生菌，促进了其对香樟的危害。对番茄潜叶蛾共生菌的研究主要集中在肠道细菌结构组成及对生物大分子、农药或次生代谢物的降解方面（常吕恕等，2022）。Chen等（2024）研究发现番茄潜叶蛾肠道细菌Enterococcus mundtii能够降解氯虫苯甲酰胺，从而提高番茄潜叶蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性；也有研究表明取食番茄和马铃薯的番茄潜叶蛾种群肠道细菌组成结构受到其寄主植物的影响，肠道细菌在寄主适应性中起着重要作用（Shang et al.，2024）。而唾液细菌是否会在番茄潜叶蛾取食过程中影响到植物的生长发育及防御反应还鲜有研究。因此，本研究采用传统的微生物分离纯培养方法对番茄潜叶蛾的唾液细菌进行分离及鉴定，并探讨不同唾液细菌体外接种后对番茄植株生长及防御的影响，为阐明唾液细菌介导番茄潜叶蛾为害番茄的作用研究提供参考，也为揭示其寄主适应机制提供依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   供试虫源及番茄植株

番茄潜叶蛾于2021年采自云南省玉溪地区露地番茄上（24˚08΄ N，101˚53΄ E），在室内用番茄活植株饲养于RXZ智能型人工气候箱中，设人工气候箱的温度25℃±1℃，相对湿度50%±5%，光周期L∶D=16∶8；目前已连续饲养30余代。

盆栽试验所用番茄种苗购自四季春种业，品种为“大粉”，将种苗根系放置水中浸泡12~24 h后栽植于盆中，花盆的上径、底径和盆高分别为20 cm、18 cm和23 cm，花盆底部有孔，种植基质为V腐殖土∶V珍珠岩=6∶1的混合基质，种植过程在室内完成且不施用任何农药和化肥。

1.1.2   主要试剂及培养基配方

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，水1 L，pH7.0。若配置固体培养基，则加入琼脂15 g。

NA培养基：氯化钠5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，水1 L，pH7.0。若配置固体培养基，则加入琼脂15 g。

1.2   试验方法

1.2.1   番茄潜叶蛾唾液细菌的分离纯化

随机选取10头番茄潜叶蛾3龄幼虫，在提取唾液前将其置于75%酒精中消毒30 s，然后用无菌水冲洗2次（周立，2020），每次1 min，用吸水纸吸干虫体表面水分后放入玻璃皿，使用无菌毛刷轻柔刺激番茄潜叶蛾幼虫，待幼虫吐出唾液后使用移液枪将唾液吸取至装有1 mL无菌水的1.5 mL离心管中。充分混匀后稀释至10^-6，10^-7，10^-8（赵晨晨，2020），分别取50 μL涂布于LB和NA固体培养基上，30℃培养箱培养48~96 h，对形态、大小、颜色有差异的单菌落进行分离纯化，直至得到纯化单菌落，将单菌落纯化物置于50%甘油中，-80℃超低温冰箱中保存。

1.2.2   番茄潜叶蛾唾液细菌的形态观察

将分离到的番茄潜叶蛾唾液细菌接种到LB培养基上进行活化，30℃恒温培养24 h后，参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》（布坎南，1992），观察记录上述分离到的单菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度和隆起状态等特征，并采用革兰氏染色法对分离到的菌株进行染色（谭啸和章熙东，2019）。

1.2.3   番茄潜叶蛾唾液细菌的分子鉴定

挑选上述分离得到的菌株单菌落接种到LB液体培养基中，在30℃，180 r/min恒温摇床震荡培养24 h后，按照DNA提取试剂盒（天根生物科技（北京）有限公司）的操作步骤提取唾液细菌DNA，提取到的DNA样品使用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）/1492R（5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）进行16S rRNA PCR扩增。扩增体系为20 μL，4 μL 10×ExTaq缓冲液，2 μL dNTPs，1 μL引物，0.4 μL ExTaq聚合酶，1 μL DNA模板，dd H₂O补足至20 μL。扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，进行35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证后送至擎科生物科技有限公司进行测序利用NCBI GenBank数据库网站上的blast功能对全长序列进行同源对比分析，下载GenBank中同源性较高序列，利用MEGA X10.0.2，使用邻接法（Neighbor-joining，NJ）进行1 000次补偿计算，构建系统发育进化树，bootstrap检验进化树可靠性（Tamura et al.，2013）

1.2.4   番茄潜叶蛾唾液细菌对番茄的体外接种及番茄生理生化指标的测定

将保存的细菌菌株分别在LB培养基上活化24 h，挑取单菌落接种于200 mL LB液体培养基中，30℃，180 r/min震荡培养24 h，6 000 r/min离心10 min后去上清液，用无菌水配制成菌悬液，再稀释至1×10⁸ CFU/mL用于接种植株。准备24株长势、株高相对一致的番茄植株，每株植株在植株中部选择大小一致的三处叶片用无菌砂轮摩擦制造轻微机械损伤，分别在伤口处接种50 μL菌液，再用无菌毛刷涂抹均匀，使用灭菌的LB液体培养基接种作为对照，接种后定期进行施肥和浇水，每个处理设置3个重复。

30 d后收集植株叶片（杨志花等，2024），对氧化应激指标进行测定：丙二醛的测定采用北京生工生物工程有限公司生产的丙二醛（MDA）含量检测试剂盒，SOD（超氧化物歧化酶）和POD（过氧化物酶）采用北京生工生物工程有限公司生产的超氧化物歧化酶（SOD）测试盒和过氧化物酶（POD）测试盒，按照说明书要求进行测定；此外，还对生长发育指标进行了测定：总蛋白含量含量测定采用Bradford法进行测定；可溶性糖和叶绿素含量的测定分别使用北京生工生物工程有限公司生产的植物可溶性糖含量检测试剂盒和植物叶绿素含量检测试剂盒，采用蒽酮比色法和分光光度法进行测定；总氮和总磷分别采用国家标准方法凯氏定氮法和钒钼黄比色法进行测定。

1.3   统计分析

试验数据使用Microsoft Excel 2020整理数据，应用SPSS 26进行单因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan氏新复极差法多重比较对各菌株处理后所得数据进行分析。

2.   结果与分析

2.1   唾液细菌的形态特征

从两种培养基上共分离得到菌落形态相异的13株细菌，其菌落均为圆形；从颜色看，有乳白色、淡黄色、淡绿色和黄色；菌株B呈现出无光泽且有凸起，5株细菌菌落呈不透明，其余7株菌株呈半透明，且均有光泽；菌株L菌落边缘不规则，其余12株菌落边缘均规则（图 1）；革兰氏染色结果表明分离得到的菌株中，革兰氏阴性菌有5株，革兰氏阳性菌有8株（表 1）。

图  1  番茄潜叶蛾唾液细菌的菌落形态

Fig.  1  Colony morphology of salivary symbiotic bacteria of Tuta absoluta

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2.2   番茄潜叶蛾唾液细菌分离鉴定

将上述13株细菌的16S rRNA序列与GenBank数据库中已知序列进行Blast比对（表 2）。13条序列与6个属的16S rRNA序列同源性较高，序列相似性在99%以上，菌株分别属于3门6属7种，分别为：厚壁菌门Firmicutes的肠球菌属Enterococcus和芽孢杆菌属Bacillus，变形菌门Proteobacteria的肠杆菌属Enterobacter和不动杆菌属Acinetobacter，放线菌门Acinobacteria的微杆菌属Microbacterium和短小杆菌属Curtobacterium。对测序获得的番茄潜叶蛾唾液细菌16S rRNA序列进行系统进化分析，结果表明其唾液细菌主要由两大类群组成，系统发育进化树共分为两大支：肠球菌属的Enterococcus mundtii和芽孢杆菌属的Bacillus amyloliquefaciens，这2个分支构成厚壁菌门，并与放线菌门短小杆菌属的Curtobacterium flaccumfaciens与微杆菌属的Microbacterium arborescens和Microbacterium oleivorans聚为一大支；肠杆菌属的菌株Enterobacter cloacae与不动杆菌属的菌株Acinetobacter rhizosphaerae聚为变形菌门的一大支（图 2）。

图  2  唾液细菌菌株16S rRNA序列构建系统发育树

Fig.  2  Phylogenetic tree was constructed from the 16S rRNA sequence of salivary symbiotic bacterial strains

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2.3   唾液细菌体外接种番茄植株试验

2.3.1   唾液细菌对番茄植株氧化应激反应的影响

与CK相比，菌株A. rhizosphaerae和E. mundtii处理后的番茄植株丙二醛含量显著提高（P < 0.05），分别提高了46.03%和48.76%，其余处理均无显著差异（P > 0.05）。番茄植株接菌30 d后的SOD活性结果分析发现接菌后处理组SOD活性与CK相比无显著差异。与CK相比，菌株M. arborescens和E. mundtii处理的番茄POD分别下降62.92%和76.83%（P < 0.05），说明番茄植株经处理后的抗氧化能力有所下降（图 3）。

图  3  不同菌株处理后番茄植株丙二醛含量及酶活

注：不同小写字母表示0.05水平下差异显著。A, A. rhizosphaerae; B, M. arborescens; C, E. mundtii; F, C. flaccumfaciens; K, M. oleivorans; L, B. amyloliquefaciens; M, E. cloacae。下图同。

Fig.  3  Malondialdehyde content and enzyme activities in tomato plants treated with different bacterial strains

Note: Difference lowercase letters represented significant differences at 0.05 level based on LSD test. The same below.

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2.3.2   接种唾液细菌对番茄植株生长发育的影响

菌株M. arborescens、E. mundtii、M. oleivorans接种植株后，番茄植株可溶性蛋白含量与CK相比分别提高了39.53%、25.10%和22.29%，其他处理无显著差异；菌株A. rhizosphaerae和E. cloacae处理组的可溶性糖水平相较CK显著下降了55.38%和55.18%；菌株A. rhizosphaerae、M. arborescens、E. mundtii、C. flaccumfaciens、M. oleivorans和E. cloacae处理的叶绿素含量均显著高于CK（P < 0.05）（图 4）。

图  4  不同菌株处理后番茄植株可溶性蛋白、可溶性糖及叶绿素含量

Fig.  4  Soluble protein, soluble sugar and chlorophyll content in tomato plants treated with different bacterial strains

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2.3.3   唾液细菌对番茄植株总氮和总磷含量的影响

接种A. rhizosphaerae、M. arborescens、E. mundtii、C. flaccumfaciens和M. oleivorans的番茄植株总氮含量与CK相比显著降低（P＜0.05）。在E. mundtii处理中，番茄的总磷含量比CK提高了36.43%（图 5）。

图  5  不同菌株处理后番茄植株总氮和总磷含量

Fig.  5  Total nitrogen and total phosphorus content in tomato plants treated with different bacterial strains

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3.   结论与讨论

昆虫的唾液腺中含有大量共生菌，随着昆虫唾液在取食过程中转染至寄主植物，干预昆虫消化过程或植物的防御反应，从而直接或间接影响植物与昆虫的相互作用，调控昆虫生长（李文阳，2024）。因此探究唾液细菌在番茄潜叶蛾与番茄互作中发挥的作用对于全面理解番茄潜叶蛾与寄主植物的互作关系是至关重要的。本研究采用传统微生物分离纯化方法，从番茄潜叶蛾3龄幼虫唾液中分离得到分属3门6属7种的13株细菌菌株，分别为肠球菌属（4株）、芽孢杆菌属（1株）、肠杆菌属（2株）、不动杆菌属（3株）、微杆菌属（2株）和短小杆菌属（1株）。大量研究表明，肠球菌属、芽孢杆菌属及不动杆菌属的部分细菌可以将食物中的纤维素代谢降解，从而满足宿主昆虫对营养物质的需求，其中肠球菌属和不动杆菌属还具有一定的淀粉降解能力（常吕恕，2023）。本研究中所分离得到的菌株中E. mundtii所占比例最高，同样地，E. mundtii也是是番茄潜叶蛾肠道的优势菌之一，有研究表明肠道细菌也是唾液菌的重要来源（常吕恕，2023），因此，唾液细菌中的E. mundtii也可能来自于番茄潜叶蛾的肠道细菌“反刍”。常吕恕（2023）通过KEGG代谢途径分析，发现E. mundtii在氨基酸、能量和脂质代谢、异生物素的降解与合成以及糖的生物合成等途径中有一定的作用。因此，E. mundtii可能通过帮助其寄主消化马铃薯叶片中的碳水化合物和脂质等营养物质为番茄潜叶蛾提供能量，从而使番茄潜叶蛾在马铃薯植株上表现出明显的寄主适应性和危害（常吕恕，2023）。

昆虫取食植物后，会对植物产生直接或间接影响，如引起植物氧化应激反应，直接干扰植食性昆虫的取食行为，甚至产生毒素或降低叶片的营养水平以影响植物的可食性（Npflin et al.，2016）。这种影响可以由布赫纳氏菌属Buchnera、路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii等引起（Wang et al.，2017；王树元等，2024）。在本研究中，E. mundtii接种番茄植株后，植株POD活性相对于对照组下降，表明番茄潜叶蛾取食时唾液中的E. mundtii可降低寄主的氧化应激反应，从而有助于番茄潜叶蛾取食。丙二醛含量升高是植物受损及受到氧化胁迫的指标之一（Zhang et al.，2000）。E. mundtii和A. rhizosphaerae接种后，处理组与CK相比丙二醛含量显著提高，说明该菌的处理对植物细胞膜系统造成的损害更严重。而M. arborescens、C. flaccumfaciens和B. amyloliquefaciens接种后，番茄植株丙二醛含量下降但差异不显著，分析原因可能是番茄植株经处理后有一定清除细胞产生的活性氧的能力（陈丹阳，2023）。可溶性蛋白作为植物体内重要的渗透调节物质和营养物质，在为植物提供营养的同时也可使受损的植物组织束缚水含量保持稳定，满足了害虫对水分的需求，使生境更加适宜害虫发展（周奋启，2011），而在接种E. mundtii、M. arborescens和M. oleivorans的处理组中可溶性蛋白相比对照组显著上升，说明唾液细菌的处理有利于番茄潜叶蛾对番茄的适应。此外，可溶性糖既是植物品质的重要构成性状之一，也与植物抗虫性密切相关的抗逆调节物质（高勇等，2012），在水稻中可溶性糖的增加可以提高自身的抗虫性（韩永强等，2017），E. mundtii接种使得番茄叶片的可溶性糖含量下降，进一步验证了番茄防御下降的结果。番茄经唾液细菌处理后叶绿素的含量相比对照组显著上升，植株体内磷含量也在E. mundtii处理后显著上升，猜测可能为番茄植株在受损后的补偿作用。综上所述，番茄潜叶蛾唾液细菌能够参与调控番茄的防御。

本研究分析了番茄潜叶蛾唾液细菌群落组成，鉴定了唾液细菌的形态及生理生化特征，明确了番茄潜叶蛾唾液细菌对番茄植株的影响。然而，唾液细菌在对寄主营养物质的降解消化功能以及调控植物防御反应的机制还不清楚，我们推测番茄潜叶蛾唾液细菌的分泌蛋白可能在调控番茄防御的过程中发挥重要作用，但唾液细菌的分泌蛋白还需进一步鉴定，差异蛋白与唾液细菌的关系尚不明确，其在调控植物防御中的功能还需进一步验证；唾液细菌对番茄植株营养成分的降解能力及唾液细菌群落在番茄潜叶蛾取食过程中发挥的作用的探究也有待进一步深入。本研究明确了唾液细菌对番茄的影响，为细菌调控昆虫-植物互作的研究提供理论基础，同时为入侵害虫番茄潜叶蛾的绿色防控提供新的靶标和途径。