Gene cloning of glutathione-S-transferase (TabsGSTs2) in Tuta absoluta and its molecular docking analysis with α-tomatine
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摘要:
谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferases，GSTs）在昆虫适应植物次生代谢物质中发挥重要作用，为明确番茄潜叶蛾Tuta absoluta的GSTs基因在其响应α-番茄碱胁迫中的作用。本研究利用PCR技术克隆了番茄潜叶蛾TabsGSTs2基因全长，通过生物信息学方法分析了TabsGSTs2基因的序列特征、理化特性、保守结构域、基因结构和进化关系，通过RT-qPCR技术测定了α-番茄碱胁迫下TabsGSTs2基因的表达情况，利用同源建模和分子对接研究了TabsGSTs2和α-番茄碱的结合能力与结合模式。结果表明，TabsGSTs2基因的CDS全长为609 bp，编码203个氨基酸，理论等电点为8.47，分子量为23.895 kDa；TabsGSTs2具有4个β-折叠和9个α-螺旋，具有典型的GSTs保守结构域，包括GSH结合位点（G-site）和底物结合位点（H-site）；TabsGSTs2属于sigma亚家族成员，与苹果蠹蛾Cydia pomonella的CpGSTs2亲缘关系较近；α-番茄碱胁迫下，TabsGSTs2基因在72 h的表达量显著高于对照；TabsGSTs2与α-番茄碱的结合能力较强，主要以氢键、疏水作用力和盐桥等相互作用维持稳定的结合。研究结果可为后续研究番茄潜叶蛾适应α-番茄碱的分子机制提供参考，为进一步挖掘番茄潜叶蛾防控新靶标提供基础。
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关键词:
- 番茄潜叶蛾 /
- α-番茄碱 /
- 谷胱甘肽-S-转移酶 /
- 解毒代谢 /
- 分子对接
Abstract:Glutathione-S-transferases (GSTs) play an important role in insect adaptation to plant secondary metabolites. To clarify the role of the GST gene in the detoxification of Tuta absoluta to α-tomatine, we first cloned the full-length sequence of TabsGSTs2 gene. Bioinformatic analysis was employed to analyze the sequence characteristics, physicochemical properties, conserved domains, gene structure, and evolutionary relationships of the TabsGSTs2 gene. The expression levels of TabsGSTs2 under α-tomatine stress were measured using RT-qPCR, and the binding capacity and mode of TabsGSTs2 to α-tomatine were investigated using homology modeling and molecular docking. The results showed that the CDS of TabsGSTs2 was 609 bp, encoding 203 amino acids, with a theoretical isoelectric point of 8.47 and a molecular weight of 23.895 kDa. TabsGSTs2 contains four β-sheets and nine α-helices, and had the typical conserved domains of GST genes, including the GSH binding site (G-site) and the substrate binding site (H-site). Phylogenetic analysis indicated that TabsGSTs2 belongs to the sigma subfamily and was closely related to CpGSTs2 of Cydia pomonella. Under α-tomatine stress, the expression level of TabsGSTs2 was significantly higher than that of the control at 72 h. Molecular docking results suggested that TabsGSTs2 bind strongly to α-tomatine, with the interaction being stabilized primarily by hydrogen bonds, hydrophobic forces, and salt bridges. Our study provides reference for subsequent studies of the molecular mechanisms of T. absoluta adaptation to α-tomatine and provides a basis for further exploration of new targets for the control of T. absoluta.
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植物次生代谢物是植物在长期进化过程中形成的一类非直接参与日常生理功能的化合物，但对植物生存和适应环境起到重要作用，尤其是起到对昆虫和病原菌的防御作用（Beran and Petschenka，2022）。植物次生代谢物质主要包括黄酮类、萜类和生物碱类化合物，生物碱是一种生物活性较强的含氮化合物，主要分为糖苷生物碱（Steroidal glycoalkaloids，SGAs）、烟碱（尼古丁）、萜类吲哚生物碱（Terpenoid indole alkaloids，TIAs）和苄基异喹啉生物碱（Benzylisoquinoline alkaloids，BIAs）（熊安平等，2021）。糖苷生物碱是番茄Solanum lycopersicum和马铃薯Solanum tuberosum等茄科植物中广泛存在的一类重要的次生代谢产物，其中，α-番茄碱（α-tomatine）是番茄中特异的一类SGA，可有效抵御病原菌和昆虫的侵害。例如，α-番茄碱对甜菜夜蛾Spodoptera exigua和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata的生长发育具有显著抑制作用，同时，损害甜菜夜蛾羽化、导致畸形、影响体重和寿命（Campbell and Duffey，1981；Kowalski et al.，2000）。用含有α-番茄碱的人工饲料饲喂斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫，随着α-番茄碱含量增加，斜纹夜蛾幼虫体重增长率显著下降（Sun et al.，2019）。da Silva等（2022）测定了4种植物次生代谢物对番茄潜叶蛾Tuta absoluta的毒性，发现α-番茄碱对番茄潜叶蛾毒性最强，依次是香豆素（Coumarin）、对伞花烃（p-cymene）、十三烷酮（Tridecanone）。
植食性昆虫在与植物长期协同进化过程中，也发展出一套针对植物次生代谢物毒性的反防御策略，即通过各种解毒代谢酶来降低次生物质的毒性，这些解毒代谢酶包括：谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）、羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarEs）和细胞色素P450酶（Cytochrome P450s，CYP450s）等解毒酶（Zhang et al.，2013；Shi et al.，2022，2023）。GSTs作为一种关键的解毒代谢酶，在昆虫的反防御机制中起重要作用，是昆虫应对环境压力和保护自身免受损害的重要机制之一。GSTs对次生物质解毒代谢主要有以下几种方式：（1）直接代谢；（2）将次生物质包裹起来，避免与靶标位点接触；（3）抗氧化活性（Koirala et al.，2022）。如斜纹夜蛾在受到α-番茄碱胁迫时，中肠和脂肪体中有大量基因上调表达，其中包括7个P450s、8个GSTs和3个CarEs等解毒代谢酶基因（Li et al.，2019）。
番茄潜叶蛾Tuta absoluta（Meyrick）属鳞翅目Lepidoptera麦蛾科Gelechiidae，是一种世界范围内的入侵害虫，该虫原产于南美洲的秘鲁，2017年8月首次被发现入侵我国新疆伊犁地区（张桂芬等，2019；Zhang et al.，2020），目前已在我国新疆、云南、贵州等20余个省（自治区、直辖市）发生与危害，严重威胁“菜篮子”保供安全。2023年11月10日，农业农村部将番茄潜叶蛾增补纳入《一类农作物病虫害名录》管理。番茄潜叶蛾主要危害茄科植物，包括番茄、马铃薯、茄子Solanum melongena和烟草Nicotiana tabacum等，尤其嗜食番茄，当防治不及时时，可造成80%~100%的番茄产量损失，是番茄的毁灭性害虫（Biondi et al.，2018，张桂芬等，2018）。目前，番茄潜叶蛾的防控主要以使用化学农药为主，然而，高强度和大量使用杀虫剂导致该虫已对有机磷类、拟除虫菊酯类、阿维菌素、双酰胺类、多杀菌素和几丁质合成抑制剂等化学农药和生物农药产生了严重抗药性（Biondi et al.，2018；Guedes et al.，2019；李晓维等，2022）。因此，亟需挖掘新的防控靶标进而研发环境友好型的防治方法。α-番茄碱是番茄主要次生代谢物，对多种害虫具有很强的毒性，但番茄潜叶蛾却能够耐受α-番茄碱，因此，研究明确番茄潜叶蛾适应α-番茄碱的解毒代谢机制将能够为其有效防控提供新的靶标。
本团队前期研究发现一个GST基因（Tabs013460.1）在以番茄为寄主植物的番茄潜叶蛾中肠中高表达，且该基因也在脂肪体中高表达（黄聪等，待发表数据），推测该基因可能参与番茄潜叶蛾对α-番茄碱的解毒代谢。因此，本研究以该基因为靶标基因，克隆获得其CDS全长序列，并对其理化特性、序列特征等进行分析，通过构建进化树明确该基因属于Sigma亚家族，利用RT-qPCR技术测定该基因在α-番茄碱胁迫下的表达情况，最后通过同源建模和分子对接研究该基因与α-番茄碱的结合能力和结合模式。结果可为后续研究番茄潜叶蛾适应α-番茄碱的分子机制提供基础支撑。
1. 材料与方法
1.1 供试昆虫
本试验所用虫源为2018年12月采自云南省玉溪市红塔区阳瑞农业科技发展有限公司有机果蔬生产基地的番茄潜叶蛾种群，并在室内利用番茄幼苗饲养至25代以上，饲养条件为温度25℃±1℃，相对湿度60%±5%，光周期L∶D=16∶8。选择同批次发育整齐的番茄潜叶蛾2龄幼虫进行相关试验。
1.2 供试试剂及仪器
试剂：98% α-番茄碱（α-tomatine）标准品为北京华越洋生物科技有限公司产品；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）为北京索莱宝科技有限公司产品；小量RNA提取试剂为简石生物技术（浙江）有限公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为日本TaKaRa公司产品；Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）、Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix（Low Rox）、2× Hieff Canace Gold PCR Master Mix高保真酶预混液、DH5α化学感受态细胞为上海翌圣生物科技有限公司产品；零背景pTOPO-TA/Blunt通用克隆试剂盒为北京艾德莱生物科技有限公司产品；Trans2K® DNA Marker为北京全式金生物技术有限公司产品。
仪器：ABI 7500实时荧光定量PCR仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；超微量紫外可见分光光度计，杭州遂真生物技术有限公司；T100 PCR仪，美国BIO-RAD公司。
1.3 总RNA提取与cDNA合成
用小量RNA提取试剂盒（简石生物技术（浙江）有限公司）提取番茄潜叶蛾3龄幼虫的总RNA。利用超微量紫外可见分光光度计（杭州遂真生物技术有限公司）检测RNA样品的完整性及浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。使用Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）反转录试剂盒合成cDNA第1链于-20℃冰箱保存备用，剩余RNA于-80℃低温冰箱保存。
1.4 基因克隆
使用Primer Premier 5.0软件根据TabsGSTs2基因全长信息设计引物扩增基因的完整开放阅读框（Open reading frame，ORF）序列。PCR反应体系（25 μL）：2× Hieff Canace Gold PCR Master Mix 12.5 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9 μL。扩增条件：95℃预变性3 min；98℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃终延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶后，于紫外光下用消毒干净刀片切下含目的片段的胶块，使用胶回收试剂盒回收纯化。目的片段连接至pTOPO-TA/Blunt载体，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞后，挑取单克隆并在液体LB培养基中振荡培养6 h，菌液经PCR验证后送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。
表 1 实验中所用引物Table 1 Primers used in the experiment引物名称Primers 引物序列（5'-3'）Primer sequence 产物大小（bp）Product size 引物用途Primer usage TabsGSTs2-F TGGTCAACGCAGCAACA 630 cDNA cloning TabsGSTs2-R GATTAAAACGAGTAAGG TabsGSTs2-qF AGAACAGGACCCCGTG 115 RT-qPCR TabsGSTs2-qR TCCGAAGAATCCGCCA RpL5-F CAGTCGTCGAGCCAGCAACA 129 RpL5-R TCCCGCATTGAAGGAGACCA 1.5 生物信息学分析
利用在线网站ExPASy Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/）预测TabsGSTs2的蛋白质分子量、等电点等理化特性。利用Python脚本（https://github.com/jackiexls/ChrLocPlotter）绘制TabsGSTs2基因在染色体上的定位图，从基因组GFF3文件中提取TabsGSTs2基因结构信息，提交至在线网站GSDS 2.0（https://gsds.gao-lab.org/）绘制基因结构图。为鉴定TabsGSTs2基因保守结构域，将其氨基酸序列提交至NCBI CDD数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），分析TabsGSTs2的保守结构域、GSH结合位点（G-site）和底物结合位点（H-site）等活性位点。为鉴定TabsGSTs2的二级结构，将TabsGSTs2的氨基酸序列和褐飞虱Nilaparvata lugens谷胱甘肽-S-转移酶NlugGSTs2基因（pdb: 5h5l）氨基酸序列合并后，利用MAFFT v7软件（默认参数）软件进行比对（Katoh et al.，2002），比对后的序列提交至ESPript 3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）进行可视化，并鉴定α螺旋和β折叠位置。
将TabsGSTs2基因的氨基酸序列与家蚕Bombyx mori（Yu et al.，2008）和苹果蠹蛾Cydia pomonella（Hu et al.，2022）的GSTs基因共计39条氨基酸序列合并后构建系统发育树，首先，利用MAFFT v7软件（默认参数）对这些基因的氨基酸序列进行多重比对（Katoh et al.，2002），比对后的序列利用trimAl v1.2软件（参数设置为：-automated1）进行裁剪（Capella-Gutiérrez et al.，2009），利用ProtTest3 v3.4.2软件（Darriba et al.，2011）计算最佳氨基酸替代模型为“I+LG”，随后利用RAxML软件（Stamatakis，2014）构建系统发育树，bootstrap值设置为1 000。
1.6 α-番茄碱胁迫下TabsGSTs2基因表达水平分析
参照先前的研究利用DMSO配置浓度为40 µg/mL的α-番茄碱溶液（da Silva et al.，2022）。供试番茄品种为“口感番茄”，番茄植株生长至50 cm高时，取植株中部羽状复叶，将番茄羽状复叶从叶柄处剪下，自然晾干，然后用裁纸刀将叶柄斜切后将叶片插入打好孔的1.5 mL离心管中，处理组离心管内添加1 mL番茄碱溶液，置于直径15 cm的塑料培养皿中，待溶液被叶片完全吸收后，挑选生长状况基本一致的番茄潜叶蛾2龄幼虫进行试验，对照为等体积的DMSO溶剂处理和清水处理，其他条件相同。每个培养皿放置5头幼虫，30头为一个生物学重复，每个处理设3次生物学重复，分别于12 h、24 h、48 h、72 h取样。
样品经液氮速冻后放置于-80℃冰箱保存。RNA提取同1.3，以番茄潜叶蛾RPL5基因作为内参基因，采用RT-qPCR方法分析番茄潜叶蛾TabsGSTs2基因的表达水平。TabsGSTs2基因RT-qPCR引物由上海生工生物有限公司合成。采用7500 Real Time System PCR仪进行两步法扩增。反应体系（10 μL）：Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O 4.1 μL。反应条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 34 s，共40个循环。
1.7 同源建模与分子对接
将TabsGSTs2基因的氨基酸序列提交至在线网站SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行同源建模获得其三维结构，随后利用在线网站SAVES v6.1（https://saves.mbi.ucla.edu/）中的ERRAT、WHATCHECK和PROCHECK程序对所构建的模型进行评估，确保同源建模所获得的模型可靠性，利用PyMOL v2.2.3软件可视化TabsGSTs2的三维结构（DeLano，2002）。从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载α-番茄碱的结构文件。利用Molecular Operating Environment（MOE）对TabsGSTs2和α-番茄碱进行分子对接以研究它们的结合模式和结合能力，对接方法参照先前的研究（Chen et al.，2022；Zhou et al.，2024）；利用在线服务器PLIP（Protein-Ligand Interaction Profiler, https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index）分析与α-番茄碱结合的相互作用力和关键氨基酸残基。
1.8 数据分析
番茄潜叶蛾TabsGSTs2基因相对表达量采用2-ΔΔCт法进行计算。试验结果以平均值±标准误（Mean ± SE）表示，并采用SPSS 26（IBM）软件对不同处理间的结果进行单因素方差分析（One-way ANOVA），平均数差异以Duncan氏新复极差检验法进行多重比较。
2. 结果与分析
2.1 番茄潜叶蛾谷胱甘肽-S-转移酶TabsGSTs2基因克隆及序列特征分析
通过PCR克隆和基因测序，获得了番茄潜叶蛾1个GST基因（基因组ID：Tabs013460.1）的全长cDNA序列，通过保守结构域分析，发现其具有N端保守结构域“GST_N_Sigma_like”和C端保守结构域“GST_C_Sigma_like”，且属于sigma亚族，因此，将其命名为TabsGSTs2。TabsGSTs2基因的CDS全长609 bp，编码203个氨基酸，理论等电点为8.47，分子量为23.895 kDa。染色体定位和基因结构分析结果表明，TabsGSTs2基因位于11号染色体，包含5个外显子和4个内含子（图 1-A）。二级结构分析表明，TabsGSTs2具有4个β-折叠和9个α-螺旋（图 1-B）。CD-search预测结果表明，TabsGSTs2蛋白的GSH结合位点（G-site）包括Tyr7、Leu13、Gln49、Leu50、Pro51、Gln62和Ser63等氨基酸残基，底物结合位点（H-site）包括Tyr95、Trp98、Lys99、Val102、Val103、Ile158和Thr161等氨基酸残基（图 1-B）。
图 1 TabsGSTs2基因染色体定位、基因结构和序列特征注：红色三角表示GSH结合位点（G-site），蓝色三角表示底物结合位点（H-site）。Fig. 1 Chromosomal localization, gene structure, and sequence characteristics of TabsGSTs2Note: The red triangle represented the GSH binding site (G-site), and the blue triangle represents the substrate binding site (H-site).
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2.2 TabsGSTs2基因与家蚕和苹果蠹蛾GST基因家族系统发育分析
为进一步明确TabsGSTs2基因与其他昆虫GSTs基因之间的进化关系，下载了19个家蚕GSTs基因氨基酸序列和19个苹果蠹蛾GSTs基因的氨基酸序列，并结合TabsGSTs2基因的氨基酸序列，经MAFFT软件比对和TRIMAL软件裁剪后，利用RAxML软件最大似然法构建系统发育树。结果表明，所有GSTs基因被划分为6个亚家族（Delta, Epsilon, Theta, Zeta, Omega和Sigma），不同亚家族的GSTs各自聚为小类群，说明GSTs在进化上相对保守，TabsGSTs2与苹果蠹蛾的CpGSTs2亲缘关系较近，并与CpGSTs1、CpGSTs3，以及家蚕的BmGSTs1和BmGSTs2一起聚在Sigma亚家族分支（图 2）。
图 2 TabsGSTs2基因和家蚕、苹果蠹蛾GST基因家族进化树分析Fig. 2 Phylogenetic relationship of TabsGSTs2 and the GSTs of Bombyx mori and Cydia pomonella下载:
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2.3 α-番茄碱胁迫下TabsGSTs2基因表达谱
为进一步探究TabsGSTs2基因是否参与番茄潜叶蛾对α-番茄碱的解毒代谢过程，将通过叶柄吸收α-番茄碱的番茄叶片用来饲喂番茄潜叶蛾2龄幼虫，待取食12 h、24 h、48 h和72 h后提取RNA，利用RT-qPCR技术测定TabsGSTs2基因的表达量。结果表明，在幼虫取食12 h、24 h和48 h后，TabsGSTs2基因在α-番茄碱、DMSO和清水3种处理下表达量无显著差异（12 h：F2，6 = 0.615，P = 0.572；24 h：F2，6 = 1.093，P = 0.394；48 h：F2，6 = 2.033，P = 0.212），但在取食72 h后，α-番茄碱处理下TabsGSTs2基因的表达量显著高于DMSO处理（P = 0.002）和清水处理（P = 0.001）下的表达量，分别上调了2.42倍和4.06倍，而DMSO处理与清水处理间差异不显著（P = 0.265）（图 3）。
图 3 α-番茄碱胁迫下TabsGSTs2基因在不同时间段表达情况Fig. 3 Expression level of TabsGSTs2 at different times under α-tomatine stress下载:
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2.4 TabsGSTs2同源建模及与α-番茄碱分子对接分析
通过同源比对发现TabsGSTs2与SWISS-MODEL数据库中褐飞虱的谷胱甘肽-S-转移酶GSTs2（pdb: 5h5l.1.A）一致性较高（38.38%），因此，利用该模板构建了TabsGSTs2的3D模型，结果表明，TabsGSTs2由4个β-折叠和9个α-螺旋组成（图 4-A）。利用SAVES v6.1服务器中的ERRAT、WHATCHECK和PROCHECK程序对所构建的模型进行评估，结果表明，ERRAT值为98.96%，远大于50%；WHATCHECK评估结果为完整；PROCHECK结果表明，TabsGSTs2有95.6%、3.3%和1.1%的氨基酸残基分别位于合理区、比较合理区和勉强接受区。由此说明，所构建的TabsGSTs2蛋白结构合理。进一步，利用MOE软件对TabsGSTs2和α-番茄碱进行分子对接，结果表明，TabsGSTs2与α-番茄碱对接打分为-8.3968，说明具有较好的结合能力，α-番茄碱位于由TabsGSTs2的α1、β2和α9组成的口袋处，相互作用的氨基酸残基包括：His9、His22、Tyr23、Ala24、Gly25、Glu26、Lys27、Phe28、Glu29、Asp30、Arg32、Pro189、Gly190、Glu193、Tyr194、Lys199（图 4-B）。其中，Tyr23、Glu26和Pro189分别与α-番茄碱形成氢键作用力，His22与α-番茄碱形成盐桥，Lys199与α-番茄碱形成疏水作用力（图 4-C）。
图 4 TabsGSTs2蛋白三维结构及与α-番茄碱分子对接研究注：A，TabsGSTs2蛋白三维结构；B，TabsGSTs2与α-番茄碱结合模式；C，TabsGSTs2与α-番茄碱结合的关键氨基酸残基。Fig. 4 Three-dimensional structure of TabsGSTs2 and molecular docking with α-tomatineNote: A, Three-dimensional structure of TabsGSTs2; B, Binding mode of TabsGSTs2 to α-tomatine; C, Key amino acid residues of TabsGSTs2 binding to α-tomatine下载:
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3. 结论与讨论
GSTs是昆虫体内三大解毒酶之一，在昆虫响应植物次生代谢物等外源有毒化合物中发挥重要作用。α-番茄碱是番茄中最丰富的一类糖苷生物碱，会严重影响昆虫的生长发育，导致畸形甚至死亡。番茄潜叶蛾是番茄的毁灭性害虫，在长期进化过程中已经形成了对α-番茄碱的耐受能力，然而，其耐受机制尤其是GSTs在其解毒代谢过程中的作用与功能尚未明确。
本研究以前期筛选获得的在脂肪体和中肠中高表达的sigma亚家族的GST基因（TabsGSTs2）为靶标，通过PCR技术克隆获得了该基因的CDS全长序列，编码203个氨基酸，理论等电点为8.47，分子量为23.895 kDa，二级结构表明，该基因具有4个β-折叠和9个α-螺旋，基因结构显示，含有5个外显子和4个内含子，结果与其他昆虫GSTs基因的序列特征和理化特性一致（Hu et al.，2022；Liu et al.，2023a；Ma et al.，2023），表明该基因属于典型的GST基因。二级结构分析结果表明，TabsGSTs2包括N端和C端功能结构域，即N端含有与GSH结合的G-site，C端含有底物结合位点H-site（Liu et al.，2023b）。多序列比对结果表明，G-site处氨基酸残基相对保守，有研究表明sigma亚家族中Tyr8在不同物种中高度保守（TabsGSTs2为Tyr7），对于结合GSH具有重要作用（Yamamoto et al.，2006）；底物结合位点H-site处氨基酸残基多样化，说明该基因功能多样化（Yamamoto et al.，2012）。
系统发育树结果表明，TabsGSTs2属于sigma亚家族，与苹果蠹蛾的CpGSTs1、CpGSTs2和CpGSTs3，以及家蚕的BmGSTs1和BmGSTs2聚为一支，其中，与CpGSTs2的亲缘关系最近。前期研究结果表明，CpGSTs2基因参与苹果蠹蛾对高效氯氟氰菊酯的抗药性（Hu et al.，2020；Hu et al.，2022），BmGSTs1基因具有前列腺素E合成酶活性，可将前列腺素H2转化为其E2形式（Yamamoto et al.，2013），BmGSTs2基因具有抗氧胁迫功能（Hirowatari et al.，2017），因此，推测TabsGSTs2基因具有多样化的功能。
昆虫主要通过解毒代谢酶基因的上调表达来对外源有毒物质进行解毒代谢，如用单宁酸处理豌豆蚜Acyrthosiphon pisum后，多个GSTs基因表达量发生上调（王继祖等，2024）；舞毒蛾Lymantria dispar在寄主植物次生物质黄酮和槲皮素胁迫下，沉默LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1等基因后显著降低幼虫存活率和影响生长发育（齐琪等，2021）；斜纹夜蛾在取食荠菜或吲哚-3-甲醇和烯丙基异硫氰酸酯等植物次生代谢物时，SlGSTe1基因显著上调表达（Zou et al.，2016），进一步研究表明，SlGSTe1基因的表达受miRNA（Sli-miR-34-5p）的调控，进而参与斜纹夜蛾对植物次生物质胁迫的响应（马康等，2019）。在本研究中，番茄潜叶蛾在受到α-番茄碱胁迫下，TabsGSTs2基因在72 h时显著上调表达，该结果与其他昆虫GSTs基因对外源物质响应模式相似，如：荻草谷网蚜Sitobion miscanthi成蚜在20 mg/L、50 mg/L和100 mg/L浓度真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇胁迫下，SmisGSTs2基因在72 h才显著上调表达（郭娇，2024）；使用LC30浓度氯虫苯甲酰胺处理美国白蛾Hyphantria cunea 3龄幼虫，GST酶活在前48 h均被抑制，而在处理72 h显著诱导GST酶活性（范程程，2023）；使用甲维盐亚致死剂量（LC30）处理龟纹瓢虫Propylaea japonica发现，不同的酶响应不同，GST酶活在前48 h无显著变化，72 h时显著上升，而羧酸酯酶（CarE）12 h时酶活性无显著变化，24 h和48 h时酶活性显著上升，72 h时酶活性无显著变化（田碧婷，2024），因此，推测TabsGSTs2基因参与番茄潜叶蛾对α-番茄碱的解毒代谢过程。
为进一步明确TabsGSTs2与α-番茄碱的结合能力与结合模式，通过同源建模构建了TabsGSTs2的三维结构，利用MOE软件进行分子对接分析，对接打分为-8.3968，结合模式结果表明，TabsGSTs2和α-番茄碱主要以氢键、疏水作用力，以及盐桥等形式进行结合，其中Tyr23、Glu26和Pro189分别与α-番茄碱形成氢键作用力，说明TabsGSTs2与α-番茄碱具有较强的结合能力。值得注意的是，α-番茄碱位于由TabsGSTs2的α1、β2和α9组成的口袋处，并不在G-site和H-site及其附近，推测可能原因是番茄碱分子量较大，不易进入TabsGSTs2的内部。也有研究报道GST以二聚体形式存在（Oakley et al.，2001），G-site和H-site及附近氨基酸残基参与二聚体形成，而N端和C端氨基酸残基主要暴露在外部，易于大分子的化合物结合。此外，外源化合物并非只与G-site或H-site结合，如松褐天牛Monochamus alternatus的MaGSTs1与噻虫啉结合位点也不在不在G-site和H-site及其附近（Yuan et al.，2024）。本研究利用α-番茄碱胁迫处理和分子对接等技术与方法探讨了TabsGSTs2基因在番茄潜叶蛾对α-番茄碱解毒代谢中的潜在作用，为番茄潜叶蛾GSTs基因的功能研究以及番茄潜叶蛾对α-番茄碱的解毒代谢研究提供了基础数据，后续将利用蛋白纯化、酶动力学特性分析、酶活抑制检测、体外代谢分析和RNAi等技术与方法，进一步明确TabsGSTs2基因在番茄潜叶蛾适应α-番茄碱胁迫的分子机制。
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图 1 TabsGSTs2基因染色体定位、基因结构和序列特征
注：红色三角表示GSH结合位点（G-site），蓝色三角表示底物结合位点（H-site）。
Fig. 1 Chromosomal localization, gene structure, and sequence characteristics of TabsGSTs2
Note: The red triangle represented the GSH binding site (G-site), and the blue triangle represents the substrate binding site (H-site).
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图 2 TabsGSTs2基因和家蚕、苹果蠹蛾GST基因家族进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic relationship of TabsGSTs2 and the GSTs of Bombyx mori and Cydia pomonella
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图 3 α-番茄碱胁迫下TabsGSTs2基因在不同时间段表达情况
Fig. 3 Expression level of TabsGSTs2 at different times under α-tomatine stress
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图 4 TabsGSTs2蛋白三维结构及与α-番茄碱分子对接研究
注：A，TabsGSTs2蛋白三维结构；B，TabsGSTs2与α-番茄碱结合模式；C，TabsGSTs2与α-番茄碱结合的关键氨基酸残基。
Fig. 4 Three-dimensional structure of TabsGSTs2 and molecular docking with α-tomatine
Note: A, Three-dimensional structure of TabsGSTs2; B, Binding mode of TabsGSTs2 to α-tomatine; C, Key amino acid residues of TabsGSTs2 binding to α-tomatine
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表 1 实验中所用引物
Table 1 Primers used in the experiment
引物名称Primers 引物序列（5'-3'）Primer sequence 产物大小（bp）Product size 引物用途Primer usage TabsGSTs2-F TGGTCAACGCAGCAACA 630 cDNA cloning TabsGSTs2-R GATTAAAACGAGTAAGG TabsGSTs2-qF AGAACAGGACCCCGTG 115 RT-qPCR TabsGSTs2-qR TCCGAAGAATCCGCCA RpL5-F CAGTCGTCGAGCCAGCAACA 129 RpL5-R TCCCGCATTGAAGGAGACCA -
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